[发明专利]血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法

说明书

本发明公开了一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，先将EDTA螯合基质环境和cTnC本身所包含的Ca²⁺，再外加Ca²⁺使cTnC和Ca²⁺重新结合，最后通过EDTA螯合和cTnC结合的Ca²⁺，对Ca²⁺检测，从而定量测量血清中所有与cTnC结合的cTnI复合物。本发明的方法明确了被测物质，实现了对待测物质的范围划定，定义了混合物中被测组分中具体形式。通过ICP‑MS法简化了蛋白质前处理步骤，消除了过程中引入的其他变量和由此导致的不确定度。不选用特征肽段进入质谱的检测方法，消除了由于异质性而产生的质荷比改变所产生的结果差异。不选用制备过程复杂表征困难的同位素标记的重组cTnI作为内标，简化了实验方案。标准物质定值结果可最终溯源到SI单位。

技术领域

本发明涉及生物诊断标志物定量测量领域，特别是涉及一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的定量测量方法。

背景技术

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是目前公认的心肌梗塞的生物诊断标志物，因为心肌梗死后肌钙蛋白浓度升高与短期发病率和死亡率之间存在极好的相关性。心肌肌钙蛋白I检验结果的准确性直接影响着心肌梗塞等疾病的诊断，对于其治疗及预防都具有重要意义。

血清基质心肌肌钙蛋白I的临床免疫检测方法丰富，但是结果差异较大，其结果受到检测方法、抗体和标准物质的影响。目前最为准确的绝对定量参考测量方法为免疫亲和富集连同同位素稀释质谱法。该方法选用标准参考物质(SRM)2921，以同位素标记重组cTnI蛋白作为内标，选取三条特征肽段对血清基质中cTnI进行定量，其变异系数(CV)范围为10.0-14.3％。在这种方法下，肽段的选取、cTnI的异质性以及个体的独特性都会对cTnI的定量产生显著影响。

生物标志物的一些标准化问题是对相关的所涉实体的定义不足。在生物样品中，cTnI作为异质混合物存在不同的分子种类，在心肌病患者的血清中可检测到完整的cTnI和多达11种的修饰产物，这种微观异质性可以通过定义混合物中被测组分中具体形式实现标准化。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，具有良好的准确性、可靠性和溯源性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种血清中心肌肌钙蛋白I复合物的非诊断目的的定量测量方法，先将EDTA螯合基质环境和cTnC本身所包含的Ca²⁺，再外加Ca²⁺使cTnC和Ca²⁺重新结合，最后通过EDTA螯合和cTnC结合的Ca²⁺，对Ca²⁺检测，从而定量测量血清中所有与cTnC结合的cTnI复合物。

具体包括以下步骤：

(1)选用SRM(E)标准物质配制CaCl₂标准浓度曲线；

(2)用EDTA缓冲液配制cTnC的浓度梯度溶液；

(3)使用磁珠免疫亲和法提取血清中心肌肌钙蛋白I复合物；

(4)将提取出的复合物中加入500μL EDTA缓冲液；

(5)将配制的cTnC溶液和提取出的心肌肌钙蛋白I复合物冰上孵育过夜；

(6)将样品4℃透析24h，分别在5h、13h、20h时更换透析缓冲液；

(7)将样品超速离心，离心条件为温度4℃、转速12000r、时间30min；

(8)加入CaCl₂缓冲液500μL，常温振荡反应4h，超速离心；