[发明专利]谷氨酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了谷氨酸脱氢酶突变体及其应用，该突变体为下列之一：将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第402位赖氨酸突变为苯丙氨酸或天冬氨酸；第406位异亮氨酸突变为苯丙氨酸或苏氨酸；第121位苏氨酸和123位亮氨酸进行组合突变；第379位丙氨酸和383位亮氨酸进行组合突变。本发明通过定向进化与半理性设计相结合的分子改造方法，显著提高了源于Pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶对2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)的催化活力；解决了还原胺化法制备L‑草铵膦工艺中谷氨酸脱氢酶酶活低的问题。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及谷氨酸脱氢酶突变体及其在催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸制备L-草铵膦中的应用。

技术背景

草铵膦(Phosphinothricin，又名Glufosinate)是一种含磷氨基酸类灭生性除草剂，化学名称为2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，是全球第三大灭生性除草剂及第二大转基因作物除草剂。草铵膦具有杀草谱广、低毒、活性高、部分传导性和环境相容性好等特点，被广泛应用于非耕地、免耕地、农田作物、水生田等杂草防除。草铵膦的两种构型中，只有L-型具有除草活性(Herbicidal compositions[P].Patent application US4265654 A，1981)，而且在土壤中易于降解，对环境的危害较小。

目前，市场销售的草铵膦都是外消旋体混合物，若能够以L-构形的纯光学异构体形式使用，草铵膦施用量将降低50％，可显著提高经济性、减轻环境压力。因此，光学纯L-草铵膦制备工艺的开发具有非常重要的意义。

谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,EC 1.4.1.2–1.4.1.4)来源丰富且性质多样，在手性L-氨基酸合成领域具有非常大的应用潜力(L-glutamate dehydrogenases:Distribution,properties and mechanism[J].Comparative BiochemistryPhysiologyB Comparative Biochemistry,1993,106(4):767-792.)。利用谷氨酸脱氢酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)不对称还原胺化制备L-草铵膦，具有立体选择性严格、理论产率能够达到100％、产物易于分离提纯等显著优势。

在公布号为CN106978453A的发明专利申请文献中，我们将来源于Pseudomonasputida的谷氨酸脱氢酶(PpGluDH,NCBI登录号：NP_742836.1)基因进行了克隆并在大肠杆菌中过量表达。该重组谷氨酸脱氢酶能够还原胺化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸生成光学纯度较高的L-草铵膦。但是，从工业化应用的角度来讲，PpGluDH的催化活力较低，这会带来催化剂制备成本过高、后处理困难等一系列问题。因此，通过分子改造提高PpGluDH对PPO的催化活力是实现该L-草铵膦还原胺化合成工艺工业化应用的关键。

发明内容

本发明针对来源于Pseudomonas putida的谷氨酸脱氢酶对非天然底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸催化活力低的问题，提供了多个酶活显著提高的谷氨酸脱氢酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用。

具体技术方案如下：

本发明提供了一类谷氨酸脱氢酶突变体，所述谷氨酸脱氢酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第402位赖氨酸突变为苯丙氨酸或天冬氨酸；

(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第406位异亮氨酸突变为苯丙氨酸或苏氨酸；

(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第121位苏氨酸和123位亮氨酸分别突变为丝氨酸和组氨酸，或天冬酰胺和酪氨酸，或缬氨酸和酪氨酸，或丝氨酸和丝氨酸，或天冬酰胺和苯丙氨酸，或缬氨酸和苯丙氨酸，或异亮氨酸和酪氨酸；