[发明专利]一种多重PCR方法

说明书

本发明公开了一种多重PCR方法。本发明公开的多重PCR方法包括：利用满足如下条件的成套引物进行PCR扩增：每个引物对的因素J小于50％，且9个因素中至多一个因素不在标准范围内；9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；标准范围如下：35％≤因素A≤60％；68℃≤因素B≤79℃；30％≤因素C≤70％；30％≤因素D≤70％；15kcal/mol≤因素E的绝对值≤70kcal/mol；因素F的绝对值＜100kcal/mol；因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤因素H的绝对值≤10kcal/mol；因素I＜100℃。实验证明，本发明的方法可用于多重PCR。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种多重PCR方法。

背景技术

PCR(聚合酶链式反应)是在基因组上设计特异性的引物序列对目标片段进行特异性的扩增。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quatitative PCR,FQ-PCR)技术、单分子PCR技术和微滴PCR技术。

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(NextGeneration Sequencing,NGS)是2004年后新兴的一系列测序技术，能一次平行对大量(几十万到几百万)DNA分子进行序列测定。已经在基因组从头测序、基因组重测序、转录组测序、表观遗传学、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)开发等等方面，将使基因组学成为研究生物学问题的常规方法，成为人们研究分子生物学、分子遗传学等等的有力工具。

在多种新一代测序技术中，Illumina公司开发的基因组分析仪(GenomeAnalyzer,GA)是由隶属英国剑桥大学的Solexa公司建立，是基于边合成边测序(Sequencing by Synthesis)原理，由于具有成本相对较低、通量大、前处理较为简单等等优势，是目前使用最广泛的二代测序技术平台。Illumina不断升级GA，特别是HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq系列测序仪研发完成。

Illumina GA和HiSeq测序平台都需要严格的样品前处理过程，并且不具有选择性，因此，如果对基因组(或转录组)中某一特定的区域感兴趣，则需要在Illumina样品前处理之前对目标区域进行选择性的富集。目前通用的选择性富集的方法包括PCR、MIP(Molecular Inversion Probe)和DNA芯片(Microarray)。其中，MIP和DNA芯片技术较为复杂，适合大量群体中目标片段的富集，成本费用高，需要的起始基因组DNA的用量大。并且这些方法都需要建立质量较高的样品文库，从而增加了实验的成本费用。PCR技术是一种具有良好的选择性并且技术要求较低的方法，虽然扩增中会产生核苷酸的突变会在Illumina的样品前处理中放大，造成过多的假阳性结果；但是随着二代测序技术的不断发展(例如Illumina GA在2006-2012年间更新了6代，Illumina Hiseq在2010-2015年之间更新了7代)，测序的成本费用在不断的降低，测序长度在不断的增加，那么增加测序深度足以能解决由于PCR选择性富集的缺陷。

发明内容

本发明所解决的技术问题是如何进行多重PCR扩增。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种多重PCR方法，所述方法包括：利用成套引物进行PCR扩增，实现多重PCR；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：

a1)所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数；

a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；