[发明专利]醛酮还原酶BmAKR1及其突变体和应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BmAKR1及其突变体和应用，所述突变体是由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶1(Bacillus megaterium aldo‑keto reductase 1,BmAKR1)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR1及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR1及其突变体通过催化苯甲酰甲酸乙酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。本发明中的突变体相对于野生型，活性及立体选择性得到了提高，催化上述底物可以获取光学纯的手性醇，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BmAKR1及其突变体和应用，所述突变体是由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶1(Bacillus megaterium aldo-keto reductase1,BmAKR1)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR1及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR1及其突变体通过催化苯甲酰甲酸乙酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。

背景技术

α-酮酸酯类化合物是一种结构简单而又特殊的化合物，具有两个羰基，其还原得到的光学醇类化合物作为重要的合成中间体在化工与医药领域得到广泛的应用，例如其还原得到的(R)-扁桃酸酯即是许多药物如半合成青霉素、头孢菌素的原料和麻黄碱、环扁桃酸酯等药物的合成中间体。传统α-酮酸酯的还原路线中常常使用贵重金属，提高了生产成本，污染也较大，有的反应所得产物收率较低而且后处理复杂。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，尤其生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视，而属酮还原酶的醛酮还原酶在α-酮酸酯的还原中具有应用价值。

醛酮还原酶(Aldo keto reductases，AKRs)是一类依赖于NAD(P)⁺的氧化还原酶，包含了超过190个成员。其结构由(α/β)₈桶状结构及loop区构成，活性中心由loop 4、loop7及loop C组成，催化活性位点包括Tyr、Asp、Lys以及His。醛酮还原酶能够催化底物的类型包含多种，例如糖醛、类固醇、前列腺素、羰基化合物及酮酸酯类化合物等。来源于不同菌属中的醛酮还原酶可催化不同类型的底物得到相应的具有手性中心的氧化还原产物，然而目前已有文献报道的具有高活性与立体选择性的醛酮还原酶仍占少数。最近已有通过蛋白质工程将自然界存在的醛酮还原酶进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，例如可通过对醛酮还原酶的loop区进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，但成功例子仍较少。因此发掘并且改造醛酮还原酶以提高其催化性能的需求较为迫切。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于巨大芽孢杆菌的醛酮还原酶BmAKR1，野生状态下对苯甲酰甲酸乙酯表现出较差的活性及立体选择性，通过理性设计及蛋白质定向进化提高该酶的立体选择性，实现光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种醛酮还原酶BmAKR1，还提供了通过对该醛酮还原酶进行突变得到的还原酶突变体，所述的醛酮还原酶BmAKR1和突变体可以提高其对α-酮酸酯类化合物的对映选择性及活性，使通过醛酮还原酶还原得到对应手性醇路线高效、可行。

本发明提供了醛酮还原酶BmAKR1，通过测序确定为野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶1，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶1(BmAKR1)基因(SEQ IDNO.1)通过突变得到具有改良性质的醛酮还原酶的突变体，该酶在大肠杆菌工程菌中表达，该醛酮还原酶及其突变体，能够将α-酮酸酯类化合物还原得到具有光学活性的S或R构型仲醇。

进一步地，将醛酮还原酶基因连接到表达质粒中，得重组醛酮还原酶。所述的表达质粒为：pET-28b-MBP。

所述的重组醛酮还原酶包括与SEQ ID NO.2至少75％同一性的氨基酸序列。