[发明专利]NK细胞的分离培养及保存入库的方法

说明书

本发明提供一种NK细胞的分离培养及保存入库的方法，将血站制备血制品过程中滤除掉的白细胞经体外诱导扩增NK细胞，对NK细胞的培养方法进行优化，包括：健康或成年人白细胞的采集、NK细胞的扩增、NK细胞的检测、NK细胞的存储及编码入库、建立可供检索的细胞信息档案。本发明中制备血制品过程中滤除掉的白细胞具有细胞数量大、功能活性强、无传染性病原体污染等特点，为临床使用非自体NK细胞治疗恶性肿瘤性疾病提供丰富的细胞来源，同时实现NK细胞的高效扩增，冻存的NK细胞复苏活力达到86％以上，复苏仅需30‑60分钟，存储时间可达15‑20年，为肿瘤治疗和预防，以及病毒感染产生的免疫系统疾病治疗和预防提供了储存新方式。

技术领域

本发明涉及免疫细胞领域，特别涉及一种NK细胞的分离培养及保存入库的方法。

背景技术

NK细胞是人体免疫系统中最重要的效应杀伤细胞之一，占外周血淋巴细胞的10％～15％，是人体防御体系的第一道屏障，通常处于休眠状态，一旦被激活，会浸润到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。NK细胞是人体先天免疫的核心组成部分，是抗肿瘤细胞免疫的基础。由于NK细胞的杀伤活性无主要组织相容性复合物(MHC)限制性，因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于肿瘤细胞后杀伤效果出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。同时NK细胞弥补了细胞毒性T淋巴细胞在杀伤肿瘤细胞时必须识别MHC-Ⅰ类分子，而无法杀伤此类分子阴性的肿瘤细胞的缺陷。肿瘤患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞，但这为采用NK细胞免疫疗法治疗肿瘤提供了一个契机。所谓NK细胞免疫疗法，即通过细胞工程的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对抗肿瘤免疫治疗的效果。

NK细胞的杀伤功能主要以下三种机制来实现：①NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞；②NK细胞通过膜TNF家族分子与靶细胞膜配体结合诱导靶细胞凋亡；③NK细胞还可以通过其表面CD16分子，与抗体结合，产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。有研究表明，具有ADCC效应的NK细胞与单克隆抗体药物联合应用，能够更好的发挥抗肿瘤作用。虽然目前有很多NK细胞扩增培养的方法，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高、不具有ADCC效应等问题。如何才能获得大量、具有ADCC效应的NK细胞仍有待进一步研究。

同时，由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(〈10％)，仅占单个核细胞的5％-10％，极大的限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，但是目前的常规技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和Y-1FN等因子组合来促进NK的扩增，经过一段时间的培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，因此也不能满足实际的应用。并且这种方法因子需求量较大，成本较高，培养效果不稳定，不适合体外大规模的应用。

发明内容

本发明旨在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。因此，本发明的目的在于提出一种NK细胞的分离培养及保存入库的方法，具有分离的NK细胞活性高、纯度高，复苏活力达到86％以上，且复苏时间短，存储时间长的优点。

一方面，本发明提供一种NK细胞的分离培养及保存入库的方法，包括以下步骤：

(1)白细胞的采集及运输；

(2)白细胞的入库；

(3)分离单个核细胞；任选地，冻存单个核细胞；

(4)扩增培养，获得NK细胞；

(5)NK细胞的冻存，编码入库并上传细胞信息档案；

(6)NK细胞检测

(7)细胞复苏后存活率、诱导NK等效率

(8)出库流程