[发明专利]NK细胞的分离培养及保存入库的方法

权利要求书

1.一种NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)白细胞的采集及运输；

(2)白细胞的入库；

(3)分离单个核细胞；

(4)扩增培养，获得NK细胞；

(5)NK细胞的冻存，编码入库并上传细胞信息档案；

(6)NK细胞检测

(7)细胞复苏后存活率、诱导NK等效率

(8)出库流程。

2.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的白细胞为血站制备血液制品(浓缩红细胞、浓缩血小板、血浆等)前废弃的滤除白细胞；所述的采集为向滤出的白细胞中加入甘油：血清得到1：9配置的保存液，放置冰盒中；所述的运输为将采集的滤除白细胞通过冷链运输快速送往细胞库。

3.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的白细胞入库是指登记捐献者信息，包括捐献者的基本信息、家族病史，病毒检测等，并对捐献者信息进行跟踪，包括捐献者采集前3个月、采集后3个月血站的检测报告，以及自检和第三方检测报告，对采集的白细胞进行计数，统计数据，最终入库。

4.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(3)中分离单个核细胞包括：制备血液制品过程中滤除的白细胞加入到含有淋巴细胞分离液的离心管中，离心后，获得外周血单个核细胞；所述步骤(3)中冻存单个核细胞包括：将单个核细胞与冻存液混合并液氮保存。

5.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(4)扩增培养包括：将单个核细胞用自体血浆、饲养层细胞A1刺激活化并加入培养液进行培养。

6.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(5)中NK细胞冻存包括：将NK细胞与冻存液混合。

7.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(6)中NK细胞检测是指扩增14天后对扩增的NK细胞进行支原体、内毒素、流式检测、细胞杀伤实验、细胞活率等实验，用于判断NK细胞的扩增质量及扩增效率。

8.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(7)中细胞复苏是指将冻存管从液氮中取出后放入37℃水浴锅中，融化后加入培养基置于培养瓶中进行培养，培养2天后对复苏的NK细胞进行细胞复苏后活率检测。

9.根据权利要求1所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述步骤(8)中编码入库的方法是：对扩增并冻存的NK细胞按照每人一组系统编号，并将个人信息包括编号和保存位置信息统一输入计算机，上传细胞信息档案，用于管理与检索。

10.根据权利要求1-6任一项所述的NK细胞的分离培养及保存入库的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1.从血站滤除白细胞中分离单个核细胞；

S2.将得到的单个核细胞按照1.0-2.0×10⁶个/mL的密度，加入到含有饲养层细胞和按体积百分含量包括1％的自体血清或胎牛血清、85-99％的KB581无血清培养液、200-1000U/mL的重组人IL-2的培养液中，放入二氧化碳培养箱中培养；

S3.将获得的NK细胞按照2-10×10⁷个/mL的密度，混合在按体积百分含量包括5-10％的二甲基亚砜、10-90％的自体血清或胎牛血清、0-5％的人血白蛋白和5-75％的基础培养液的冻存液中，并将其编码入库。