[发明专利]以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法

说明书

本发明涉及一种物种鉴定领域，是一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法，其特点是根据三带喙库蚊COIII基因序列设计特异性引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴定三带喙库蚊各种形态如成虫、卵、幼虫和蛹等。能对三带喙库蚊进行鉴定，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

口岸蚊类种群鉴定主要手段为形态学鉴定，依靠有形态学鉴定经验和蚊类形态鉴定能力的口岸检验检疫人员，根据医学蚊类分类检索表进行鉴定。然而，形态学鉴定面临很多问题：蚊类专业鉴定人才少，人员培养周期长；鉴定人员的经验程度、专业水平、蚊类完整性与发育阶段等因素可导致鉴定周期长，效率低；一些复杂的种群如近缘种群和同形种群难以鉴定；对于蚊类卵、幼虫和蛹，为获取其可靠鉴定特征，经常需要蚊类人工培养后鉴定；口岸送检蚊类若数量较大，对口岸蚊类鉴定工作是非常大的考验；等等。因而，口岸蚊类鉴定除了提高检疫人员鉴定能力和研发鉴定辅助系统外，仍需要发展安全、快速、准确、灵敏的鉴定方法，以实现蚊类快速鉴定。

近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单链构象多态性（SSCP）、DNA条形码技术等分子手段已经应用于蚊类种群鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：常规检测特异PCR产物序列，依赖于较贵的分子探针或产物测序；RFLP鉴定蚊种不仅耗时，而且需要大量样本；RAPD鉴定蚊种快速，但结果不稳定，且有时不可重复；SSCP只能作为检测蚊类基因突变的方法，要确定突变的位置和类型，需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；DNA条形码技术的后续测序工作耗时、耗经费。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现蚊类种群的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法可作为三带喙库蚊新的鉴别手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行蚊类鉴定，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。

本发明是由以下技术方案来实现的：

本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊特异性鉴定引物，序列如下：

COIII-F：5’- CGATGAGGAATAATTTTATT -3’

COIII-R：5’- CAGTAAAGAATAAACTTTGAG -3’。

利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒，它包括如成分：

1）三带喙库蚊COIII基因的特异性引物

COIII-F：5’- CGATGAGGAATAATTTTATT -3’

COIII-R：5’- CAGTAAAGAATAAACTTTGAG -3’。

2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧

光染料；

3）三带喙库蚊基因组；

4）ddH2O；

5）25 mM MgCl2。

本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊方法，包括如下步骤：