[发明专利]基于LAMP法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明包括用于环介导等温扩增(LAMP)的外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，其序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示，以及用于扩增反应的缓冲液，dNTP和酶等。本发明的特点在于引物特异性好、准确性高，不需要特殊仪器，操作简便，可以用于肺炎克雷伯菌的快速检测。

技术领域：

本发明涉及一种检测试剂盒，尤其是涉及一种环介导等温扩增(LAMP)技术结合量子点发光来检测肺炎克雷伯菌。

背景技术：

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科，克雷伯菌属的成员，为一种重要的革兰阴性、人兽共患的条件致病菌。该菌主要引起人和多种动物的肺炎、呼吸道感染、肠炎、肝脓肿、腹膜炎、脑膜炎、腹泻，甚至败血症。多重耐药、强致病性肺炎克雷伯菌菌株的出现给养殖业造成了巨大的经济损失，同时也给人类食品安全造成了严重威胁。因此，建立早期快速检测方法对肺炎克雷伯菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。

传统的病原菌检验方法主要通过分离培养的方法，根据病原菌的生理生化特征进行鉴别，但是分离培养需要特殊的实验室设备和人员，耗时长；另一种常用的血清抗体检测方法，也需要血清中抗体达到一定的水平，难以做到初期的快速诊断。PCR技术是近年来常用的肺炎克雷伯菌快速检测方法之一，如专利CN 104946762A公开了一种检测肺炎克雷伯菌的试剂盒，并使用荧光定量PCR方法进行检测，这类方法虽然灵敏性和特异性高，但是月存在操作繁琐，需要特殊的热循环仪，如PCR仪或荧光定量PCR仪等，效率较低。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展的一种新的核酸扩增技术，只需要在60-65℃恒定温度条件下反应60分钟就可以完成扩增反应，不需要热循环仪，具有特异性强、操作简便、灵敏度高等优点。

对于LAMP扩增产物的检测，主要有以下方法：1.浊度法，通过扩增过程产生的焦磷酸根与反应体系中的镁离子结合生成沉淀，表明体系中出现了扩增反应，其缺点是白色沉淀引起的浊度通常较弱，不易被观察到；2.颜色变化，如在反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)，反应生成的焦磷酸根离子与HNB竞争性地与镁离子结合，使HNB从紫罗兰色变成天蓝色来判别反应的发生。本发明采用羟基萘酚蓝染色的方法，可以不开盖，直接从反应体系颜色的变化判断结果。

本发明具有特异性好、准确性高，不需要特殊仪器，操作简便等特点，可以用于肺炎克雷伯菌的快速检测。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种快速检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒。

为达到上述目的，本发明首先提供了四条特异的LAMP引物，引物序列如下：

外引物F3：5’GTTTCTGTACAGACGACGGA 3’；

外引物B3：5’CGAAGACGAACACAGCTT 3’；

内引物FIP：5’GGAACAAACACCACGAGGAACAGTGTTGAGGTGTATCGTC 3’；

内引物BIP：5’TTGCGTAATGATCTGCGCTGAGCGGAGTGGCGTGAT 3’；

本发明提供的LAMP扩增反应体系，当为30μL反应体系时，其优选配置为：

本发明提供的LAMP扩增反应，优选的反应条件为65℃，扩增60分钟。

本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，反应管变成绿色为阳性，保持淡橙色的为阴性。两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：NTC(-)和POS(+)