[发明专利]一种枯草芽孢杆菌葡萄糖酸盐诱导表达元件及构建方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌葡萄糖酸盐诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。本发明以组成型启动子P_lytE表达转录调控蛋白GntR，进一步通过在组成型启动子P_thrS中，整合转录调控蛋白GntR结合序列，实现以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为宿主时，添加葡萄糖酸盐后，达到较高强度的诱导表达水平和较低的泄漏表达水平，其诱导表达强度达到22500a.u.，泄漏量从15.6％降低至3.0％，为筛选基因工程菌或调控蛋白表达奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌葡萄糖酸盐诱导表达元件及构建方法，属于遗传工程领域。

背景技术

在枯草芽孢杆菌代谢工程领域，响应小分子物质诱导表达的启动子元件，广泛应用于代谢调控等方向。目前，常用于枯草芽孢杆菌中的诱导启动子，有木糖诱导启动子P_xyl和IPTG 诱导启动子P_grac。但是，木糖诱导启动子P_xyl存在木糖价格昂贵的问题，IPTG诱导启动子P_grac，存在IPTG价格昂贵，以及对细胞存在一定毒性的问题。其次，木糖和IPTG诱导启动子均存在较高的泄漏表达问题。以上缺陷，严重限制了其在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。葡萄糖酸盐作为一种简单碳源，价格低廉，且对细胞无毒，是一种合适的诱导物。通过基因工程改造启动子，可以获得更合适于枯草芽孢杆菌的诱导响应元件。然而，如何改造启动子，以响应葡萄糖酸盐实现较高的诱导表达强度，以及较低的泄漏表达水平，是一个值得深入研究的问题。仅通过解除枯草芽孢胞杆菌PgntWT原始启动子的碳源代谢阻遏效应，不足以实现响应葡萄糖酸盐的强诱导表达响应元件(参见2016年公开的论文《Bacillussubtilis GntR regulation modified to devise artificial transient inductionsystems》)，其诱导表达强度远低于木糖和IPTG诱导启动子，因此，限制了葡萄糖酸盐诱导表达元件在枯草芽孢杆菌代谢工程领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，实现响应于葡萄酸盐的诱导表达启动子元件，并使其达到较高诱导表达水平，以及较低的泄漏表达水平。

本发明的第一个目的是提供一种诱导表达启动子元件；该元件响应的诱导底物为葡萄糖酸盐；所述元件为含有GntR蛋白、P_lytE启动子、P_thrS和GntR结合序列的质粒；所述P_lytE启动子调控GntR蛋白；所述P_thrS与GntR结合序列整合，整合后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子P_lytE和启动子P_thrS的转录方向相反。

在本发明的一种实施方式中，所述P_lytE启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述转录调控蛋白GntR含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述转录调控蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为pHT01、pP43NMK或pSTOP1622质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述元件中还含有GntR启动子；编码所述GntR启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述GntR蛋白、P_lytE启动子和整合GntR结合序列的启动子 P_thrS设置在同一质粒上。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒的核苷酸序列如SEQ NO.11所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述葡萄糖酸盐诱导表达元件的基因工程菌。