[发明专利]一种检测J亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测J亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用。包括包被截短表达的ALV‑J gp85蛋白的酶标板，其中，所述的截短表达的ALV‑J gp85蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用截短表达的J亚群禽白血病病毒(ALV‑J)gp85蛋白建立了ALV‑J抗体间接ELISA检测方法，试验表明，该方法特异性好，与AB亚群ALV抗体无交叉，且其敏感性和特异性优于同类进口试剂盒，本发明的提出为ALV‑J的检测和流行病学调查以及ALV‑J的早期诊断提供了有效技术手段。

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体检测试剂盒及其应用，特别涉及一种检测J亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒及其应用，本发明属于病毒检测技术领域。

背景技术

禽白血病病毒(Avian Ieukosis Virus，ALV)属反转录病毒科，禽C型反转录病毒属，可引起禽类多种肿瘤性疾病。禽白血病主要危害有两个方面，一是产生肿瘤，导致鸡的死亡；二是该病属于蛋传性疾病，会将病毒通过生殖道传播给子代雏鸡，进而引起下一代鸡发病；而且，还可以引起鸡的免疫抑制，继发其他细菌和病毒的感染，造成严重的经济损失。1997年和1998年，J亚群禽白血病在世界范围内爆发，给养禽业造成了巨大的经济损失。2008年以来，我国蛋鸡和地方品种鸡爆发了严重的禽白血病，病原主要以J亚群禽白血病病毒(ALV-J)为主，给我国的养禽业造成了严重打击，同时也严重威胁我国家禽种源安全。为此，禽白血病被纳入到《国家动物疫病防治中长期规划(2012-2020)》、《全国兽医卫生事业发展规划(2016-2020年)》和《农业部关于促进现代畜禽种业发展的意见(2016年)》中优先防治与净化的疫病。

目前，该病尚无有效的疫苗和药物可用，预防本病的主要方法是淘汰阳性鸡，净化种群。自1868年，Roloff报道禽白血病以来，研究工作者就对其进行长期的研究，并在病毒的分离、鉴定、检测和诊断方面取得了相当大的成就。建立了很多禽白血病病原的检测方法，如病毒中和试验、琼脂扩散实验、补体结合试验、ELISA、放射免疫、免疫荧光技术等。然而抗体检测方法报道较少。自2008年以来，我国蛋鸡和地方品种鸡J亚群白血病的广泛流行，给我国养禽业造成了巨大的经济损失，因而急需开展禽白血病的净化。虽然抗原检测试剂是禽白血病净化中主要使用的检测试剂，但抗体检测是评价净化效果和鸡群是否感染禽白血病病毒的重要技术手段。

因此，建立一种能够快速，灵敏的检测J亚群禽白血病病毒抗体的方法是控制该病大规模流行的有效手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测J亚群禽白血病病毒抗体的ELISA试剂盒，并建立了基于该试剂盒的检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

ALV-J的囊膜蛋白gp85含有抗原决定簇，是决定病毒亚群的蛋白，有许多病毒抗原位点。然而以全长gp85表达产物为包被抗原，与其他亚群禽白血病病毒诱导的抗体有一定的交叉反应，特异性不是很好，为了提高特异性，本发明发明人分析比对了常引起鸡群发病的A(ALV-A)、B(ALV-B)和J亚群ALV(ALV-J)的gp85氨基端序列，选取了同源性尽可能低的氨基酸序列片段，构建了截短表达ALV-J gp85的稳定表达细胞系，实现了截短gp85蛋白的稳定表达。前期的研究证明，真核表达的gp85蛋白可以结合ALV-J的细胞受体，具有完全正确的构象和功能。在本发明中，发明人以真核表达的截短的ALV-J gp85蛋白为包被抗原，建立了检测ALV-J抗体的间接ELISA方法。结果表明，该方法的最低检出血清稀释度为1：102400，而美国IDEXX公司ALV-J抗体检测试剂盒为1：25600，敏感性比进口试剂盒高4倍。另外，在特异性实验中，IDEXX公司ALV-J抗体检测试剂盒除了与ALV-J的血清反应外，同时还与ALV-A和ALV-B阳性血清有交叉反应，而本发明建立的ELISA方法仅能与ALV-J阳性血清反应，特异性优于进口试剂盒。