[发明专利]一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法

说明书

本发明提供了一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法。本发明的方法，包括如下步骤：a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4‑丁二醇二甲磺酸酯。本发明的方法对牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好，同时牙鲆的存活率高达85％以上。

技术领域

本发明涉及生殖细胞移植技术领域，具体涉及一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法。

背景技术

近年来，生殖细胞移植(Germ cell transplantation GCT)这一新兴生物技术的应用越来越广泛，而选择适宜的受体能够大大加快性别选择育种的进程。作为生殖细胞移植受体的前提条件是其生殖腺自身生殖细胞凋亡并且能够支持供体的生殖细胞发育和增殖。自Brinster等人在啮齿目动物建立了生殖细胞移植体系以来，已在羊、牛、猪、猴等动物实验中获得成功。在上述动物的生殖细胞移植实验中，通常采用化疗药物处理、放射线照射处理或者高温处理方式进行。

目前，在鱼类生殖细胞移植实验中，受体制备方法包括针对虹鳟的二倍体、三倍体法，针对斑马鱼、金鱼的吗啉反义寡核苷酸注射法等。然而，上述方式均无法适用于牙鲆成鱼，即：无法在保证牙鲆存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供一种促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，该方法对牙鲆精巢生殖细胞的凋亡效果好，牙鲆的存活率高。

本发明提供的促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，包括如下步骤：

a)在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，直至牙鲆的精液完全消化；

b)在第二高温下对经所述第一次培育的牙鲆进行第二次培育，在第二次培育阶段向牙鲆注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯(即白消安)。

目前，有少量针对罗非鱼等成鱼的高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法的相关报道。例如，针对罗非鱼的性腺枯竭实验是在26℃左右的高温培育条件下直接以40mg/kg/BW左右的剂量腹腔注射1,4-丁二醇二甲磺酸酯4次，高温培育时间为56天左右，即在高温开始时进行第一次注射，间隔14天注射1次，连续注射4次后继续高温培育14天左右。

本发明人采用现有性腺枯竭实验中的高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法进行了大量的试验，研究发现即便调整或优化现有高温培育的温度、时间以及1,4-丁二醇二甲磺酸酯的注射次数、剂量等均无法在获得针对牙鲆精巢生殖细胞良好凋亡效果的同时保证牙鲆的存活率。例如，对经过了生殖期(即非生殖期)的3龄牙鲆雄鱼进行4次注射，结果发现死亡率高达56％左右；又如，对生殖期的3龄牙鲆雄鱼进行2次注射，结果发现即便在较低剂量下注射，然而注射1-2次牙鲆雄鱼几乎全部死亡。

本发明人经大量研究发现，现有高温结合1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射法无法适用于牙鲆雄鱼的原因可能在于，现有方式均是针对非生殖期雄鱼或者是在精液存在的情况下对雄鱼进行性腺枯竭实验。研究发现：在精液存在的情况下，注射较低剂量的1,4-丁二醇二甲磺酸酯会导致大量的精子同时凋亡而不能短时间排泄，从而无法在保证存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。鉴于上述发现，从而完成了本发明。

本发明促使牙鲆精巢生殖细胞凋亡的方法，在性腺枯竭实验之前先在第一高温下对生殖期的牙鲆进行第一次培育，以使牙鲆的精液完全消化；此时，在随后进行的性腺枯竭实验体系中不存在精液，即：精液不会对后续在第二温度下进行的第二次培育及1,4-丁二醇二甲磺酸酯注射处理产生不利影响，该方式能够在保证存活率的同时实现对牙鲆精巢生殖细胞良好的凋亡效果。

本发明对第一次培育的条件不作严格限制，只要能够使牙鲆的精液完全消化即可。在本发明中，“精液完全消化”指的是通过人工挤压已肉眼看不出精液排出；此外，可以通过组织切片等常规方式检测精液是否完全消化。