[发明专利]II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其专用引物和探针

说明书

本发明公开了II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其专用引物和探针，其专用引物和探针：JX02‑M‑F：5'‑CGAGAATAGATGCAGTGGACG‑3'，JX02‑M‑R：5'‑CACAAATAACCCTTCTCCCGT‑3'，JX02‑M‑P：5'‑荧光基团‑TATAGTCGATGACCAGAGG‑淬灭基团‑3'；将包含上述专用引物和探针的微滴式数字PCR检测试剂盒用于检测II型草鱼呼肠孤病毒，与传统PCR技术相比，其不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低，实用性强。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及II型草鱼呼肠孤病毒的检测技术，具体涉及II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其专用引物和探针，及在检测II型草鱼呼肠孤病毒的应用。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起草鱼出血病的病原，隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。GCRV在中国、越南、缅甸等国家均有报道，其流行广、危害大、死亡率高、发病季节广，每年4至9月全国各地均有报道。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国第一大淡水养殖品种，据2015年全国渔业统计情况记载，我国草鱼年产量567.62万吨，占全国大宗淡水鱼类养殖产量的18％左右，是目前全球产量和消费量最大的淡水养殖鱼类品种之一。但因病害影响，尤其是草鱼出血病的流行，对1龄和2龄幼鱼的致死率达80％以上，严重影响养殖户对该品种的养殖积极性。该病不仅能够感染草鱼，还能感染青鱼(Mylopharyngodon piceus)、稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)等养殖品种，我国农业部将其列为二类传染疫病。截至目前研究发现，主要有三种基因型的毒株流行，分别为GCRV-873和GCRV-JX0901(genotype I)，GCRV-HZ08(genotype II)以及HGDRV(genotype III)，II型草鱼呼肠孤病毒是我国主要流向毒株。

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR相比，该方法不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且微滴技术让数字PCR成本更低，实用性强。

发明内容

本发明的主要目的在于提供II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR专用引物和探针。

本发明的另一目的在于提供II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，包含上述专用引物和探针，用于检测草鱼呼肠孤病毒时，其不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低，实用性强。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

第一方面，II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR专用引物和探针如下：

JX02-M-F：5'-CGAGAATAGATGCAGTGGACG-3'，

JX02-M-R：5'-CACAAATAACCCTTCTCCCGT-3'，

JX02-M-P：5'-荧光基团-TATAGTCGATGACCAGAGG-淬灭基团-3'；

其中，所述荧光基团为VIC，所述淬灭基团为BHQ-X。

第二方面，II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，包含上述微滴式数字PCR专用引物和探针，还包括阳性对照和阴性对照。