[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用

权利要求书

1.一种用于新金色分枝杆菌的基因编辑方法，其特征在于，所述方法为使用一种CRISPR/Cas9基因编辑系统；

所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包含pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒；

所述pML-Cas9质粒包含pMV261表达载体、Cas9基因、Pj23119启动子以及NHEJ修复基因；所述pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了Tac启动子；所述NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表达载体的Tac启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游，由Tac启动子驱动表达；所述Pj23119启动子位于pMV261表达载体的KanR抗性基因的下游；所述NHEJ修复基因位于Pj23119启动子的下游以及pMV261表达载体的复制起点（ori）的上游，由Pj23119启动子驱动表达；

所述pJM-sgRNA质粒依次包含OriM复制子、pMB1复制子、Pj23119启动子、sgRNA序列、rrnB终止子以及aadA抗性基因，命名为pJM-sgRNA质粒；所述sgRNA序列是靶向序列，可特异性靶向靶序列；所述靶序列是指需编辑基因的核苷酸序列；

所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

编码所述pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒中的Pj23119启动子的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

编码所述DNA末端结合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

编码所述DNA连接酶LigD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的一种用于新金色分枝杆菌的基因编辑方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统中的pML-Cas9质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pML-Cas9质粒上的Cas9基因、编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因表达，然后将权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统中的pJM-sgRNA质粒导入新金色分枝杆菌中，使得pJM-sgRNA质粒转录生成sgRNA序列，sgRNA序列中的Cas9 handle和Terminator会形成茎环结构，Cas9基因会识别此茎环结构以与sgRNA序列结合形成复合物，此复合物会靶向需编辑基因并锚定在需编辑基因上，锚定后，Cas9基因会发挥活性切割需编辑基因使得新金色分枝杆菌中需编辑的基因被敲除，需编辑基因的敲除会使得新金色分枝杆菌基因产生DSB断裂，此时，pML-Cas9质粒上的表达的DNA末端结合蛋白mku以及DNA连接酶LigD会修复DSB断裂，完成新金色分枝杆菌基因的编辑过程。

3.权利要求1或2所述的一种用于新金色分枝杆菌的基因编辑方法在编辑新金色分枝杆菌基因方面的应用。