[发明专利]横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及横跨内含子的高危型人乳头瘤病毒mRNA的检测方法及试剂盒，同时公开了该试剂盒的检测方法。该方法包括标本的核酸提取纯化，使用一步法多重RT‑PCR系统扩增检测18种中高危型HPV mRNA和内参基因。针对18种中高危型HPV设计的引物和探针，可快速实现特异性高危HPV mRNA的检测及分型检测，特点是通过设计横跨内含子的寡核苷酸引物或探针来实施特异性mRNA的检测。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感度高、特异性好、分型准确、可实时分析等特点，为HPV的普查和宫颈癌防治提供了快速准确的分子检测方法，同时大大降低了检验成本，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术核酸诊断领域，尤其涉及高危型人乳头瘤病毒专一性检测mRNA 的引物、探针及试剂盒，及其检测方法，并包括分型检测方法。可以单管不完全分型，也可以通过多管扩增实施中高危型的分型检测。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属乳头多瘤空泡病毒科，是一种嗜上皮细胞病毒，为无包膜的双链环状DNA病毒。其基因组共由3个基因区组成，包括早期区(E区)、晚期区(L区)和与非编码区(UCR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共 7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有编码衣壳蛋白的L1和编码次要衣壳蛋白的L2。L1较为保守，特异性适中，L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。UCR含有复制起点和调控转录与表达所必需的元件。HPV可归类成120多种基因型，其中有50余种定向感染人体生殖道皮肤及粘膜的复层鳞状上皮，导致尖锐湿疣糜烂，可能引起癌症的发生。根据其是否可以引起癌变，HPV亚型可分为“低危”型、“中危”、“高危”型，“低危”主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死(CIN)，“高危”的感染是引发宫颈癌的主要致病因素，“中危”则是介于二者之间。在大多数情况下，免疫系统能在HPV造成伤害之前将其清除，95％以上的生殖道HPV感染能在3-5年内痊愈，但也有少数HPV感染不能被清除，经过多年的系列病变后，发展为宫颈癌。宫颈癌是危害女性健康的第2大恶性肿瘤，而高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。HPV感染使宫颈癌的相对危险性增加了250倍，从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。约99.7％的宫颈癌都是由高危型HPV造成，尤其是HPV 16、18、31、33、35的反复或持续感染所致。因此，高危HPV 病毒是目前最明确的致癌病毒，高危型HPV的检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。另一方面，研究表明至少50％有性活动的成年人在其一生中曾感染HPV，至少80％的妇女在50岁之前曾感染HPV。但80％HPV感染者2年内会自行消退，这部分人如果以 HPV DNA作为检测靶标，将会呈阳性。只有20％的HPV感染者会进一步发展，即E6/E7基因整合到人类基因组通过转录出E6/E7 mRNA后翻译为E6/E7蛋白，诱发癌前病变及宫颈癌。因此，以高危HPV DNA为检测靶标的分子诊断试剂已在普遍使用，可以用作排除宫颈癌的手段之一：未检出高危型HPV DNA，一般提示不会发生宫颈癌；检出高危型HPV DNA，也未必会发生宫颈癌，需持续跟踪检测。因此，如果把高危DNA与发生宫颈癌概率作为临床研究来看，高危HPV DNA的检测有很高的临床阴性预示值，却有较低的临床阳性预示值。现有研究表明，以高危HPV m RNA尤其是E6/E7 mRNA或E1/E2 mRNA作为检测靶标可以大幅度提高阳性预示值，而不降低阴性预示值。故当前HPV m RNA的检测正成为研究热点。