[发明专利]一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法

说明书

本发明涉及蛋白质药物技术领域，尤其是一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，包括以下步骤；步骤一：AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；步骤二：利用AzMMMan化学修饰Protein A得到Protein A‑AzM‑DBCO‑X；利用AzMMMan化学修饰Protein B得到Protein B‑AzM‑DBCO‑Y；本发明通过AzMMMan化学修饰的蛋白与其他药物分子点击化学反应交联结合形成纳米颗粒，不仅延长其血液循环时间，而且因EPR效应靶向至肿瘤组织，在酸性条件下可逆释放出蛋白，保留活性，协同治疗,与传统PEG化蛋白类药物来延长半衰期但生物活性大大降低相比，此法可在酸性条件下可逆释放出蛋白药物，保留其生物活性，且该策略可以用做所有体内环境下不稳定或者体内办衰期不够长的药物蛋白的剂型改进。

技术领域

本发明涉及蛋白质药物技术领域，尤其涉及一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法。

背景技术

蛋白类药物如干扰素（IFN），白介素（IL）等在临床上已经得到了广泛应用，但是，蛋白类药物在体内容易被酶解，失去活性，影响其发挥抗肿瘤作用，点击化学反应，通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成，其代表反应为炔基与叠氮基团的环加成反应，其反应迅速，条件简单，效率高，副产物无害等优点使得点击化学反应在高分子，材料领域得到广泛应用，Linker AzMMMan，作为马来酸酐衍生物，一方面酸酐键可与蛋白上氨基结合，且酸性条件下可释放出蛋白；另一方面其叠氮基团可与二苯基环辛炔（DBCO）点击化学反应结合，形成牢固的复合物，目前对于蛋白上氨基的化学修饰大多是不可逆的，即修饰后无法恢复到原有状态，使得蛋白生物活性降低或失活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种基于AzMMMan化学修饰的蛋白制备方法，包括以下步骤；

步骤一： AzMMMan化学修饰蛋白和其与相关分子点击化学交联的制备；

S1、有机小分子AzMMMan化学修饰蛋白的制备：利用相关蛋白上侧链氨基与有机小分子AzMMMan的酸酐键在碱性条件下反应，连接形成酰胺键；

S2、由AzMMMan修饰后的蛋白与相关分子点击化学交联的制备：利用AzMMMan修饰后的蛋白上带有的叠氮基团与相关分子上被修饰后带有的二苯基环辛炔在弱碱性条件下发生点击化学反应，连接形成氮杂环；

步骤二：利用AzMMMan化学修饰Protein A得到Protein A-AzM-DBCO-X；利用AzMMMan化学修饰Protein B得到Protein B-AzM-DBCO-Y；

S1、将CAT溶解于pH 9.0的HEPES缓冲溶液中，将由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan缓慢滴加至改缓冲液中，室温下反应4小时得到CAT-AZ；

S2、将Pt-COOH以少量二甲基亚砜为溶剂，EDC/NHS活化半小时，随后将其加入至有HSA的PBS缓冲溶液中且pH 8.0，避光反应12小时，再加入由少量乙腈溶解的有机小分子AzMMMan，反应4小时得到Pt(IV)-HSA-AZ ；

S3、将CAT-AZ、Pt(IV)-HSA-AZ和DBCO-Ce6 置于pH8.0的PBS缓冲溶液中避光反应4-6小时得到HSAP-DC-CAT。

优选的，所述Protein A-AzM-DBCO-X中的Protein A 代表辅助药物治疗的相关功能蛋白；X代表Ce6等光动力肿瘤治疗药物、顺铂等化疗药物，或者其他治疗方式的肿瘤药物。