[发明专利]无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用

说明书

本发明涉及昆虫细胞系，公开了一株无Sf‑RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。该细胞株是从商业来源Sf9细胞筛选得到，命名为Sf9‑ZY细胞株，其生物保藏号为CCTCC NO:C201952。杆状病毒在Sf9‑ZY细胞株增殖水平和蛋白表达量检测表明，Sf9‑ZY细胞株可替代Sf9细胞作为昆虫细胞‑杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞，应用于表达重组蛋白制备生物制品。本发明提供的Sf9‑ZY细胞株解决了昆虫细胞‑杆状病毒表达载体系统(BICS)的宿主细胞污染Sf‑RV病毒问题，保证了生物制品的安全性。

技术领域

本发明涉及昆虫细胞系，具体涉及一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。

背景技术

在1969年Vaughn等建立了昆虫细胞系，分离于雌性草地夜蛾蛹的卵巢组织，当时的培养基中补加2.6％的热灭活的昆虫血，建立后，这个细胞系提供给了英国牛津大学的NERC无脊椎动物病毒学部，在那里这个细胞系被适应到了补加新生牛血清的培养基中，从而取代了补加昆虫血的培养基，此时的细胞株称为IPLB-Sf-21-AE，后来又提供给了美国德克萨斯A&M大学，在那里被克隆化，应用于蛋白表达体系。Sf9细胞株是由G.E.Smith和C.L.Cherry从IPLB-Sf-21-AE克隆而来，细胞形态更加均一，对多角病毒敏感，适用于分泌蛋白的表达，而且采用无血清培养基生长良好。

但2014年Ma和他的同事发现，每个Sf细胞系，包括两个商业来源Sf21和Sf9细胞，被污染了一种新的弹状病毒Sf-rhabdovirus(Sf-RV)，这对基因工程疫苗和抗体生产带来的安全性威胁。对Invitrogen公司来源的Sf9细胞进行Sf-RV检测，结果表明也污染了这种病毒。

昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(BICS)是基因工程四大表达系统之一，是一个以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的表达系统，它具有安全、高效、容量大、重组病毒易于筛选、表达产物能进行折叠和修饰具有生物活性，等特点，它是一种真核表达系统，具有重组蛋白表达量高，能够在一个载体上表达多种蛋白，容纳较大片段的外源DNA插入，细胞培养易于大规模获得蛋白等特点，在基因工程疫苗和抗体方面具有广阔的应用前景，广泛的应用于生物制品的生产。

然而，在Sf细胞系中发现的新弹状病毒(Sf-RV)引起了人们对昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统生产的生物制剂安全性的担忧。虽然截止目前，并没有证据表明Sf-RV病毒对人类或动物构成威胁，然而，在生物制品制备过程中一旦发现了任何外源病毒污染，都必须采取一切办法将它去除，保证生物制品的安全性。

本发明对无Sf-RV病毒的Sf9细胞株的研究属于首次。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用。

本发明第一方面提供一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株，其生物保藏编号为CCTCCNO:C201952，命名为Sf9-ZY细胞株。

本发明第二方面提供一种上述无Sf-RV污染的Sf9细胞株的筛选方法，具体技术方案如下：

(1)制备单细胞悬液：将商业来源的Sf9细胞在无血清昆虫细胞培养基(Gibco Sf-900ⅢSFM)于27℃恒温培养箱中静止培养传代1代后，采用传代培养2-3天的Sf9细胞或细胞融合度大于95％时，加入无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，轻轻吹打瓶底细胞，制备细胞悬液，采用自动细胞计数仪，对细胞悬液进行计数，保证细胞活率在98％以上；