[发明专利]无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一株无Sf-RV污染的Sf9细胞株，其特征在于：其生物保藏号为CCTCC NO:C201952，命名为Sf9-ZY细胞株。

2.一种如权利要求1所述的无Sf-RV污染的Sf9细胞株的筛选方法，其特征在于：通过以下方法筛选得到：

(1)制备单细胞悬液：将Sf9细胞在无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基于27℃培养箱培养中传代1代后，采用传代培养2-3天的Sf9细胞或细胞融合度大于95％时，加入无血清Gibco Sf-900ⅢSFM培养基5ml，轻吹打瓶底细胞，制备细胞悬液，采用自动细胞计数仪，对细胞悬液进行计数，保证细胞活率在98％以上；

(2)细胞悬液稀释：取Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，补加2％小牛血清，将细胞悬液稀释至1×10⁵个/ml后，经1:100(v/v)、1:1000(v/v)、1:10000(v/v)系列稀释，至每毫升10个细胞，分别选1×10³个/ml、1×10²个/ml、1×10个/ml细胞，接种96孔板，每孔种0.1ml，用封口膜将96孔板封口，扫描拍照后，置27℃恒温培养箱中静止培养；

(3)细胞培养：每间隔2～3天将96孔板扫描拍照，观察集落形成情况，每7天更换补加2％小牛血清的Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，培养直至第28天；

(4)细胞传代：取上述步骤(3)中96孔板中有单个集落生长的孔，用微量移液器将集落细胞轻轻吹打，原孔培养，置27℃恒温培养箱中静止培养；

(5)6孔板传代：取上述步骤(4)中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，将细胞悬液转移至6孔板，每孔补加2ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；

(6)细胞培养、传代扩增及冻存：取上述6孔板中传代培养3～4天细胞，用微量移液器轻轻吹打成细胞悬液，转至25cm²细胞培养瓶，每孔细胞悬液补加3ml Gibco Sf-900ⅢSFM培养基，置27℃恒温培养箱中静止培养；将培养3～4天的25cm²细胞培养瓶中细胞，轻轻吹打下来，转移至50ml转瓶中，接种密度为5×10⁵个/ml，置27℃恒温培养箱中转动培养，转速为100～120rpm；取转瓶培养的细胞，用自动细胞计数仪计数，测定细胞活率，保证活率大于90％，将细胞800rpm室温离心5分钟，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞密度在1×10⁷个/ml，分装至冻存管，梯度降温后，移至液氮罐长期保存；

(7)筛选出的细胞株命名为Sf9-ZY细胞株，建立三级细胞库。

3.根据权利要求1所述的无Sf-RV污染的Sf9细胞株在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统中的应用。