[发明专利]基因组靶向修饰方法

说明书

本发明涉及一种基因靶向修饰的方法，所述方法基于多元件的正负载体敲入策略，结合利用基因组定点修饰技术，将所述正负载体敲入目的基因。所述载体包含正元件和负元件。正元件中包含能够还原目的基因表达的基因编码序列，因而不会破坏基因的功能，负元件则主要是破坏內源基因功能的元件，同时，可以根据不同的目的设计外源DNA序列，从而达到荧光标记与转换、基因精确突变、基因拯救等多种效果。

本申请要求于2018年4月20日提交中国专利局、申请号为201810357493.2、发明名称为“基因组靶向修饰方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因组修饰领域，更具体涉及一种基因组靶向修饰的方法。

背景技术

近年来，基于TALEN和CRISPR/Cas等人工核酸酶的基因组定点修饰技术正越来越广泛地应用于生命科学基础理论研究，在农业、医疗健康等领域也展现出巨大的应用潜力。目前该类技术在制备indel等简单突变体方面的应用已经较为成熟，但是在制备条件性基因敲除(conditional knockout，或称组织特异性基因敲除)、对基因组进行精确修饰等复杂应用方面仍然存在效率低、周期长等问题，从而严重制约了基因功能的深入与精细研究，以及疾病模型构建与基因治疗等应用。

构建条件性基因敲除和基因标记的经典方法主要是利用同源重组(homologousrecombination，HR)介导的基因敲入将外源DNA序列引入靶基因中。但是HR事件在细胞中发生的概率很低，因而极大地限制了HR介导的基因敲入效率。人工核酸酶诱导DNA发生双链断裂(DSB)后，细胞主要是通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行损伤修复。因此，基于NHEJ进行基因敲入(靶向插入)可以获得比HR更高的效率，但是，该策略无法实现一次性构建条件性敲除的基因。而且现有的技术也无法在同一个胚胎/个体中同时实现条件性敲除和基因/细胞标记。

因此，迫切需要提供一种基因组的定点修饰技术，能够高效实现基因组水平的条件性基因敲除，还可以根据研究者需求，在实现条件性敲除的同时，实现其它更为复杂的基因组靶向修饰与细胞标记。

发明内容

本发明人经过多年的研究，为了实现高效快速的条件性基因敲除，同时实现基因标记，以及进一步实现基因型标记和/或等位基因类型的转换(例如正常等位基因向突变型等位基因的转换)，设计了一种基于多元件的正-负载体(positive-negative donor，PoNedonor；或称正-负供体)敲入策略，结合利用基因组定点修饰技术(如TALEN或CRISPR/Cas系统)，将所述正-负载体敲入目的基因，从而创建出兼有条件性基因敲除与基因标记等效果的双功能等位基因(dual-function allele)。其中，所述载体包含正元件(Positivecassette，Po-cassette)(元件1)和负元件(Negative cassette，Ne-cassette)(元件2)。正元件中包含能够还原目的基因表达的基因编码序列，因而不会破坏基因的功能，并且还可以连接荧光报告基因，从而在保持原有基因表达的同时，标记基因的内源表达情况。同时在正元件中还原基因表达的编码序列的两侧放置两个位点特异性重组酶的识别位点(例如同向排列的loxP序列)，利用位点特异性重组酶(例如Cre重组酶)可以介导loxP之间的序列从基因组中删除，从而实现条件性基因敲除。负元件则主要是破坏内源基因功能的元件。同时，可以根据不同的目的设计外源DNA序列，从而达到荧光标记与转换、基因精确突变、基因拯救等多种效果。

本发明包含如下技术方案：

1.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(1)在待修饰基因的选定位置处制造双链缺口，其中所述选定位置位于待修饰基因的内含子中；

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；