[发明专利]一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶及其构建方法

说明书

本发明公开了一种定点突变的黑曲霉6‑4光修复酶及其构建方法，所述的光修复酶具有有SEQ ID NO:1，所示的核苷酸序列。本发明从现有的WT黑曲霉中获得6‑4光修复酶基因基因序列，进行人工密码子优化之后，设计突变引物得到突变的基因片段，连接基因片段与pET22b质粒，构建出重组表达质粒；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于光修复酶表达的基因工程菌在20℃和1mM IPTG条件下获得了较好的表达。相比于WT光修复酶，本发明表达出的突变体酶S460N的活性更高，而且活性保持更加持久稳定，能更好的修复紫外线造成的DNA损伤，更有利于作为化妆品类，医药类产品的添加成分应用于人们的生活。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种黑曲霉DNA光修复酶基因及其构建方法。

背景技术：

随着科学技术的发展，人类破坏自然的活动加剧，造成大气中臭氧层稀薄甚至产生空洞，阻挡紫外线的能力减弱。于是到达地球表面的中波紫外线(UVB，280nm-315nm)剂量逐渐增强，导致人类各种皮肤损伤的发病几率大大增加。其原理是UVB能直接被皮肤细胞DNA吸收，引起DNA上两个相邻的胸腺嘧啶产生稳定共价结合的二聚体，包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和6-4光产物(6-4photoproduct)，这两类二聚体破坏DNA正常结构，从而抑制DNA的复制与转录，引起细胞内信号通路的紊乱，从而造成皮肤疾病甚至是皮肤癌。

光修复酶是一类在细菌、真菌、植物和动物中都普遍存在，在修复紫外线造成的DNA损伤中发挥重要作用的酶。自然条件下CPD与6-4光产物这两类光致损伤分别占损伤总量的80-90％和10-20％，分别由CPD光修复酶和6-4光修复酶进行修复。光修复酶通常是一类单体蛋白，以非共价的形式结合了1到2种具有发色团的辅酶，其中一种是FAD，为最常见的黄素辅酶形式。与自然界中利用NADH或是亚铁血红素类似，FAD作为电子传递的中间体，可以通过得失一个或是两个电子完成氧化还原反应，传递电子。FAD主要存在三种基本形式：完全氧化型(oxidized，OX)；单电子还原态即自由基型(semiquinone，SQ)；双电子还原态即完全还原型(hydroquinone，HQ)。在光修复酶中，必须依赖双电子还原态FAD辅酶执行功能。

CPD光修复酶和6-4光修复酶两者具有高度同源的氨基酸序列和极其相似的结构，并且反应机制也大致相同。含有底物的DNA双链靠近光修复酶，双链打开，损伤的DNA会深入到光修复酶的底物结合口袋，形成一种酶-底物的复合物。在光照条件下，光修复酶中完全还原型状态(hydroquinone，HQ)的FAD通过直接吸收光子的能量，或是通过第二辅酶传递到HQ，形成激发态HQ，接着HQ激发态上的电子传递到DNA损伤底物上，使得二聚体的底物断裂成正常的胸腺嘧啶，DNA结构恢复。最后，额外的电子会传递到中性自由基状态的FADH●，还原为FADH^-，整个修复过程极其短暂。尽管两类光修复酶同源性较高，但是两类光修复酶作用底物十分专一，只能修复特定的底物，而不能互换。

自1999年德国科学家报道光修复酶修复受损人类臀部皮肤的研究后，将光修复酶作为化妆品的添加成分，逐渐成为防晒产品的主流。以往研究人员对CPD光修复酶的研究已经很充分了，而对于6-4光修复酶的研究较为稀缺。

发明内容：

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的第1个技术问题是提供了一种黑曲霉6-4光修复酶基因。

本发明所要解决的第2个技术问题提供是含有该基因的表达载体。

本发明所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。

本发明所要解决的第4个技术问题是所述光修复酶的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种定点突变的黑曲霉6-4光修复酶基因，该6-4光修复酶具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。