[发明专利]一种高效的一步组装多个基因片段的方法

说明书

本发明公开了一种高效的一步组装多个基因片段的方法，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤为：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR，先通过特异性引物的overlap PCR获得较纯的大片段PCR，再通过Gibson组装到目标载体，获得基因全长。本发明相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装应用该方法可大大缩短3k‑8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。

技术领域

本发明属于基因片段组装技术领域，具体地，涉及一种高效的一步组装多个基因片段的方法。

背景技术

合成生物学研究逐渐发展迅速掀起一股潮流，关键在于DNA大片段组装方法的突破。将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研究中非常基础且重要的一步。在启动子和外显子功能研究、蛋白质功能研究以及基因操作等传统领域中DNA连接技术都有广泛的应用。

尽管现在开发了同源重组依赖的体内DNA大片段组装等技术，但是在基因组大片段克隆上仍然存在不足，首先大片段扩增的能力有限，其次长片段的突变率会随之增加，但是对于一个完整大片段的测序和回复突变都是需要很长的时间和花费很大的精力。对于全基因合成技术，是通过不对称PCR技术合成初期的PCR片段，但是此PCR片段不可能一次合成很长。所以要通过一定的拼接策略，往往要多轮PCR，但是这样又会带进去较多的突变。同时单纯的使用PCR合成的长度非常有限，往往Ikb左右，目前销售的cloneeazy系统可以实现分段克隆，所以一些拥有此专利的公司能够实现较长DNA片段的合成，但是此系统需要分段测序，合成速度较慢。在多基因载体构建方面，随着生物学研究的深入，将突破单个基因研究进行多基因相互协调的研究，单个基因进行转化将不能胜任。所以将多个基因构建在同一个载体上并且进行一次性转化的技术将非常必要，目前虽然有一些多基因组装系统，但是操作相对复杂。每个基因加入需要多步的操作，而且不能实现无缝连接。

发明内容

本发明的目的在于为了解决上述的问题，而提供一种高效的一步组装多个基因片段的方法，本方法相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装，且应用该方法可大大缩短3k-8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高效的一步组装多个基因片段的方法，包括overlapPCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：

步骤(1)overlapPCR：设计引物时，upper1和lower2除了是各自目标片段的引物外，还是整个长片段产物的引物，即在考虑错配位点时，既要考虑目标片段还要考虑长片段。lower2和upper2是保证连接的关键引物，它们均由两部分组成，一部分与各自目标片段互补，另一部分与待连接的另一片段互补，保证这两条引物之间的互补区包含至少20bp。

第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；

第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；