[发明专利]一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒，试剂盒包括两组引物，第一组引物用于检测O157:H7与O55:H7菌株独有的lpf2C基因，上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二组引物用于排除O55:H7菌株，上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。本发明的试剂盒根据GenBank上大肠杆菌O157:H7独有的保守序列设计，具有很高的特异性和敏感性，操作简便。为临床快速区分和鉴定大肠杆菌O157:H7菌株提供新的方法和选择。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒，该试剂盒利用大肠埃希菌O157:H7和大肠埃希菌O55:H7菌株独有的lpf2C基因型，以及两种细菌中lpf2D基序的差异作为分子标记，利用该序列设计两对特异性的引物，通过常规PCR扩增特征性基因片段进行检测。

背景技术

埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli) 是革兰氏染色阴性，呈杆状的兼性厌氧菌，通常存在于温血动物的胃肠道。其中，血清型O157:H7大肠杆菌是肠出血型大肠杆菌（enterohemorrhagic E. coli, EHEC）中最重要的一类，在世界范围内引起人类和动物的爆发感染。该菌感染剂量低，侵入人体后，可以引起出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等，具有非常重要的公共卫生意义。为了及时、准确地监控可能发生的爆发感染，建立敏感、特异和可靠的技术用于快速而选择性的检测大肠杆菌O157:H7是极其必要的。

实验室对大肠杆菌O157:H7的传统鉴定方法基于选择性培养基，该方法要求分离纯化菌株，然后再选择性培养基上划线培养，全部流程耗时长，人力成本高，同时根据显色反应造成的误判结果也多，不利于对该类细菌的监控快速、准确的要求。近年来，由于分子生物学技术的发展，运用PCR 技术检测大肠杆菌O157:H7的方法也有很多被建立，选择志贺毒素stx1 和stx2、LEE毒力岛eae、菌毛fimA、鞭毛fliC等基因中的一个或者多个作为分子标记。然而虽然鉴定该类基因可以在一定程度上帮助对O157:H7菌株的预警，但由于大多基因并不是O157:H7菌株所独有，因此其结果也并非100%的可靠。

长极性菌毛（LPF）是大肠杆菌中广泛存在的一类菌毛，根据其在细菌基因组的位置可以分为LPF1型和LPF2型，而对LPF操纵子的基序分析后，可以再将LPF1分为5个基因型，LPF2分为3个基因型。本研究团队根据GenBank上已有的O157:H7全基因组数据分析显示，全部O157:H7菌株包含独有的LPF1-3和LPF2-2基因型菌毛的操纵子，说明该操纵子内基因可以作为候选分子标记。但是该两种基因型的菌毛操纵子同时还存在于O157:H7菌株的祖源菌株O55:H7菌株中，并不能直接用于O157:H7菌株的判定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种快速、简便、特异性强、适合临床使用的特异性PCR检测试剂盒，用于快速鉴别大肠杆菌O157:H7菌株。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提供一种肠出血性大肠埃希菌O157:H7检测试剂盒，所述试剂盒包括两组引物，第一组引物用于检测O157:H7与O55:H7菌株独有的lpf2C基因，上、下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；第二组引物用于排除O55:H7菌株，上、下游引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

优选的，所述试剂盒还包括PCR 预混液和DNA 聚合酶，其中预混液包括：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂。