[发明专利]一种采用液质联用检测人血浆中呋塞米的方法及应用

说明书

本发明涉及一种液质联用检测人血浆中呋塞米的方法及应用，属于生物分析领域。本发明采用以氘代内标为沉淀剂的蛋白沉淀预处理方法，采用Inertsil C8‑3柱等度洗脱，电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。采用本发明的检测方法，呋塞米在7.5~1500 ng/mL线性范围良好，呋塞米基质效应因子为107%，血浆基质不影响呋塞米准确定量，提取回收率为99.2%。本检测方法，专一性选择性强、灵敏度高、检测快速、用量小，满足简单、可靠、高通量、条件可控的临床大批量样品分析需求。本发明方法可用于评价呋塞米各剂型的生物等效性。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及液质联用定量检测血浆中呋塞米浓度的方法及应用。

背景技术

呋塞米主要用于治疗充血性心力衰竭、肝硬化和肾疾病等引起的水肿，通过作用于髓袢升支粗段，抑制 Cl^－和 Na⁺的吸收而起效，血浆蛋白结合率约为97%。呋塞米生物利用度存在显著的个体内及个体间差异，属于高变异类药物。目前，有关呋塞米药代动力学研究的报道较少，而在中国人群中的研究更是有限。呋塞米的化学结构如下所示：

Markus于2013年建立了液液萃取液相检测方法，使用血浆0.5 mL，血浆用量较多不适用于大批量的样品检测，使用荧光检测器，选择性较差，前处理使用液液萃取法，需要氮气吹干后复溶，操作复杂且耗时。

杨小敏于2013年建立了液液萃取液质联用方法并初步应用于临床肾衰竭患者的血药浓度，该方法使用双氯芬酸钠作为内标，前处理中用10%甲酸调节pH，且使用液液萃取方法，步骤多，耗时长。最低定量下限为12.8 ng/mL，无法完整检测其药动学特征。

曾晶于2016年建立了蛋白沉淀液质联用方法用于评价呋塞米片中国健康受试者的生物等效性，该方法虽然定量下限低，线性范围宽，但血浆用量0.2 mL较多且样品处理过程复杂，不适用于大批量的样品处理。该方法使用尼美舒利作为内标，不适合质谱检测，色谱运行时间较长约4.7min，不适用于大批量的样品检测。

鉴于上述的缺陷，为满足临床大批量样品分析的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及血浆药物浓度测定方法，用于呋塞米的测定。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快的检测人血浆中呋塞米浓度的方法。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容如下：

一种采用液质联用检测人血浆中呋塞米的方法，包括以下步骤：

（1）人血浆样品前处理：人血浆样品通过蛋白沉淀法进行前处理；

（2）液相色谱-质谱联用检测：以Inertsil C8-3作为色谱柱，采用呋塞米-d5作为内标，以乙腈和0.15％甲酸-水作为混合流动相，混合流动相中乙腈和0.15％甲酸-水的体积比为85:15；其中，0.15％甲酸-水中含5mM乙酸铵；流速0.7 mL/min，柱温40℃，进样量7 μL；

（3）人血浆中呋塞米浓度的测定。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.15％甲酸-水作为混合流动相，以Inertsil C8-3作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且因其检测时间短，适用于高通量、大批量样本的检测。本发明提及的0.15％甲酸-水：甲酸的体积为甲酸与水的混合溶液总体积的0.15％。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性，向流动相中加入改性剂等。本发明采用的0.15％甲酸-水中含5mM乙酸铵。本发明在流动相中适当加入乙酸铵，进行洗脱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和较快的分析时间。