[发明专利]水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用

说明书

本申请公开了一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2‑Lys47的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2‑Lys47的方法，所述方法采用膜技术及一次柱层析技术，从而获得高纯度的水蛭素突变体HV2‑Lys47。本申请还公开了由此制备的水蛭素突变体HV2‑Lys47在抗凝采血管中的应用及包含水蛭素突变体HV2‑Lys47的抗凝采血管。

技术领域

本申请涉及生物工程技术，尤指从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQ ID NO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，及由此得到的纯化的水蛭素突变体HV2-Lys47。

本申请还涉及生物医疗器械，尤指由上述方法纯化制得的水蛭素突变体HV2-Lys47在抗凝采血管中的应用。

背景技术

天然水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出的多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，归因于可促进肿瘤中的血流而使疗效增强。

由于天然水蛭素产能较低，临床应该量大，国内外开展了大量重组水蛭素研究，自上个世纪八十年代末研制出与天然水蛭素结构相似、作用相同的重组水蛭素，产能大。

然而，现有蛋白和肽类的纯化基本都需要两种或三种以上的多次层析分离才能拿到纯品，并且洗脱剂包含大量的水和盐，对环境污染大，污水处理工程压力大。

目前市场所用的水蛭素突变体的抗凝活性为16000ATU/mg，纯度为93％左右。

比如，陈华友等(安徽农业科学，2009年，37(34)；第16757-16759页及第16768页)公开了发酵液经离心、三氯乙酸处理、超滤浓缩脱盐，再上阴离子交换柱，S100分子筛柱，最后得到95％的纯品；韦利军等人(2004年全国生物技术学术研讨会论文集，第104-112页)公开了使用大孔树脂层析、DEAE层析、反相色谱层析的三次层析法分离得到95％纯品。其中，层析步骤越多，成本越高且越费时，环境污染也越高。

因此，存在对工艺简洁、废水少、适合工业放大的水蛭素突变体HV2-Lys47的提取纯化方法的需求。

此外，血液标本的采集和分离在临床生化检测中至关重要，是保证质量的一个重要环节。传统的标本采集从开始采血到血清析出上机检测，往往需要较长时间，使全自动生化分析仪的高效性受到限制。部分生化实验室使用肝素抗凝血浆，取血后可以立即离心分离出血浆上机检测，但无论肝素钠还是肝素锂抗凝血浆，对某些生化指标都会产生影响。

1997年我国开始推广真空采血技术，是对传统采血方式的一次重大改进。由于是在全封闭系统下完成采血程序，因而从根本上排除了血液污染和交叉感染的可能性，采血更安全、更准确、更规范，因而易于普及和推广。在真空采血管内可加入分离胶、促凝剂，以及各种抗凝剂，以管帽的颜色来区分不同用途的采血管。

近年来，含促凝剂和分离胶的真空采血管在生化检验被广泛使用，它大大缩短了血液凝固的时间，一般放置20min后就可进行离心分离出血清，但有一定比例的采血管离心效果不佳，血清中存在蛋白凝丝或凝块。分离胶是一种由数种化合物组成的半固体惰性胶，不影响血清各成份的含量，但促凝管因促凝剂的原料产地、性质、制作工艺不同，可能对生化检测造成不同的影响。