[发明专利]水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，所述水蛭素突变体HV2-Lys47的序列为SEQ ID NO.: 1所示，其中大肠杆菌发酵液是通过以pBH-2为表达载体的菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）pBH2CGMCC No 0908培养生产的，所述方法包括以下步骤：

在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白，所述在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液是在65℃-67℃下保持5-20分钟；

通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；

通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；

将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；

将所述干粉溶解在水中并过滤除杂；

使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；

将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；

通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；

通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以除去杂蛋白；

通过纳滤膜来处理通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；

将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；

将所述干粉溶解在水中并过滤除杂；

使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；

将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在将所述干粉溶解在水中并过滤除杂中，通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，进行真空干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，进行冷冻真空干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过离心机来处理高温灭菌的发酵液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述离心机为管式离心机或碟式离心机。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液是在65℃-67℃下保持10分钟。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾中的一种或更多种。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述分子筛柱层析选自由sephadex G25、sephadex G50、sephadex G75和sephadex G100组成的组。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中，浓缩经由分子筛柱层析得到的收集液是通过减压真空浓缩、纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩来进行的。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈中的一种或更多种。