[发明专利]一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法

说明书

本发明提供了一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法，涉及遗传转化技术领域。本发明所述建立方法，包括以下步骤：将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上，得愈伤组织；将所述愈伤组织接种于继代培养基上，得继代愈伤组织；将目的基因转入所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；将所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的平板培养基上；将经过所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上，得丛生芽；将所述丛生芽接种于壮芽培养基上，得壮芽；将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上，得转基因金钗石斛。本发明所述体系基于组培快繁体系建立，为利用分子生物学手段对金钗石斛观赏性状和药用特性进行遗传改良奠定了技术基础。

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法。

背景技术

金钗石斛兰科石斛属又名万丈须、金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草等，为多年生草本，因形像古代头上的发钗而得名。金钗石斛茎丛生，上部稍扁而稍弯曲上升，高10～60cm，粗达1.4cm。总状花序从老茎中部以上部分发出，花大，白色带淡紫色先端，有时全体淡紫红色或除唇盘上具1个紫红色斑块外，其余均为白色；花型奇特，灰色淡雅，是优良的观赏植物种类。

金钗石斛为2015年版《中国药典》药材石斛的正品之一。性寒，味苦、淡、苦；入胃、肾经。石斛作为药用最早见载于《神农本草经》，距今有2000多年的历史。距今约1700年，在公元220～450年出版的《名医别录》中也有着对石斛药用的记载，可见其应用历史非常的悠久。

但无论作为观赏植物还是作为药用植物，目前，我国对金钗石斛种质资源的应用仍仅限于对野生资源的引种、驯化和栽培。对其观赏性状或药用成分及含量的改良仍处于探索阶段，尤其未见利用分子生物学手段对其进行遗传改良的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法，基于再生体系建立，为利用分子生物学手段对金钗石斛观赏性状和药用特性进行遗传改良奠定了技术基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L；

(2)将步骤1)得到的所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L；

(3)将目的基因转入步骤2)得到的所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；

(4)将步骤3)得到的所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的固体培养基上进行共培养；

(5)将经过步骤4)所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m^-2·s^-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d；