[发明专利]一种建立金钗石斛遗传转化体系的方法

权利要求书

1.一种金钗石斛的转基因方法，包括以下步骤：(1)将金钗石斛无菌苗接种到诱导培养基上进行诱导培养，得愈伤组织；所述诱导培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖25～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 1.3～1.5mg/L和NAA 0.15～0.25mg/L；

(2)将步骤1)得到的所述愈伤组织接种于继代培养基上进行继代培养，得继代愈伤组织；所述继代培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L和NAA 0.05～0.15mg/L；

(3)将目的基因转入步骤2)得到的所述继代愈伤组织中，得侵染愈伤组织；

(4)将步骤3)得到的所述侵染愈伤组织接种于1/2MS的固体培养基上进行共培养；

(5)将经过步骤4)所述共培养的侵染愈伤组织接种于分化培养基上进行分化培养，得丛生芽；所述分化培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖24～35g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.8～1.2mg/L、NAA 0.05～0.15mg/L、多壁碳纳米管0.8～1.5mg/L和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；所述分化培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为10～15d；所述光照培养的时间为20～25d，所述光照培养的光照度为100～300μmol·m^-2·s^-1，所述光照培养的光照时间为12～16h/d；

(6)将步骤5)得到的所述丛生芽接种于壮芽培养基上进行壮芽培养，得壮芽；所述壮芽培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L、琼脂6～9g/L、6-BA 0.3～0.8mg/L、0.1mg/L NAA和抗生素100mg/L；所述抗生素包括壮观霉素和特美汀；

(7)将所述壮芽接种于生根和壮苗共培养基上进行生根和壮苗共培养，得转基因金钗石斛；所述生根和壮苗共培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖35～45g/L琼脂6～9g/L、6-BA 1.5～3mg/L、NAA 0.1～0.4mg/L和IBA 1.4～2.5mg/L。

2.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养的培养温度为25±1℃，所述诱导培养的光照强度为100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14～20h/d。

3.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(2)所述继代培养为暗培养，所述暗培养的温度为25±1℃。

4.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(3)所述目的基因转入采用农杆菌介导的方法。

5.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(4)所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为65～80h。

6.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(6)所述壮芽培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14～20h/d。

7.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(7)所述生根和壮苗共培养的培养温度为25±1℃，所述壮芽培养的光照强度为100～300μmol·m^-2·s^-1，光照时间为14～20h/d。

8.根据权利要求1所述转基因方法，其特征在于，步骤(7)得到所述转基因金钗石斛后，还包括转基因植株的鉴定。

9.根据权利要求8所述转基因方法，其特征在于，所述鉴定包括显色鉴定。

10.根据权利要求9所述转基因方法，其特征在于，所述鉴定时，分化出黄色的植株即表明目的基因成功整合到金钗石斛基因组中。