[发明专利]一种利用甲酸还原NAD类似物的方法

权利要求书

1.一种利用甲酸还原NAD类似物的方法，其特征在于：以甲酸、甲酸盐、氘代甲酸、氘代甲酸盐中的一种或两种以上的任意比组合的甲酸化合物为还原剂，可利用该还原剂的酶为催化剂，与NAD类似物混合，反应获得还原型NAD类似物；所述催化剂为经过基因工程突变的酶，所述突变的酶为来源于Pseudomonas sp. 101的NCBI 登录号为P33160.3的甲酸脱氢酶的突变体，具体为：突变体E4、突变体A2、突变体4C4和突变体3A3中的一种或两种以上；其中，突变体E4的突变位点为V198I/C256I/P260S/E261P/S381N，突变体A2的突变位点为C256I/E261P/S381I，突变体4C4的突变位点为V198I/C256I/P260S/E261P/S381N/H224C，突变体3A3的突变位点为V198I/C256I/P260S/E261P/S381N/S383F；

所述NAD类似物为烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸（NTD）和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸（NUD）中的一种或两种以上，其化学结构如下：

，

反应在pH 3-9的缓冲液中进行，反应温度10-40℃；反应初始，酶的终浓度为4 μg/mL-500 μg/mL，NAD类似物的终浓度为0.01 mM -100 mM、甲酸化合物的终浓度为0.4 mM -25mM。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述可利用还原剂甲酸化合物的酶为具有以甲酸化合物为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：反应在pH 4-8的缓冲液中进行，反应温度15-40℃；反应初始，酶的终浓度为20 μg/mL-400 μg/mL、NAD类似物的终浓度为0.2 mM、甲酸化合物的终浓度为0.9 Mm-18 mM；所述的缓冲液为磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液中的一种或两种以上。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：反应在pH 7.5的缓冲液中进行，反应温度25℃；反应初始，酶的终浓度为100 μg/mL、甲酸化合物的终浓度为10 mM。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述还原型NAD类似物，用作其它酶的辅酶，用于还原反应，所述其它酶包括：苹果酸酶ME-L310R/Q401C，D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R，酿酒酵母醇脱氢酶，羟基丁酮脱氢酶，D-木糖脱氢酶中的一种或两种以上。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述可利用甲酸化合物的酶表达在微生物的细胞内，而NAD类似物及甲酸化合物进入细胞，反应在细胞内进行。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：反应在细胞内进行，所述微生物包括原核微生物和真核微生物。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的原核微生物包括大肠杆菌或乳酸乳球菌中的一种或两种。

9.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的真核微生物包括酿酒酵母、里氏木霉或圆红冬胞酵母中的一种或两种以上。