[发明专利]一种快速检测产四环素类抗生素降解酶细菌的方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种能够检测产四环素类抗生素降解酶细菌的质谱方法，包括以下步骤:S1.细菌与药物共培养：将待测细菌进行培养，得到培养液，并加入四环素类抗生素标准品溶液（四环素类抗生素的终浓度为140~160μg/mL），混匀后30~40℃条件下孵育6~10h；S2.样品前处理：将孵育好的共培养物离心，吸取上清液，在靶板上进行点靶，自然晾干，随后用α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸覆盖并再次自然晾干；S3.样品的测定和数据分析：将步骤S2中经过点靶后的靶板采用质谱法进行检测，分析质谱范围依四环素类抗生素的种类而定。本方法具有灵敏度高、准确度高及分辨率高的特点，适用于产四环素类抗生素降解酶细菌的检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种快速检测产四环素类抗生素降解酶细菌的方法。

背景技术

自1984年四环素降解酶机制首次报道以来，已有十余种四环素类抗生素降解酶基因被检出，包括tet(X)，tet(34)，tet(37)和tet(47)-tet(56)等。其中，tet(X)基因尤为值得关注，它能够通过羟基化作用降解第一代(如四环素，金霉素和土霉素)、第二代(如多西环素和米诺环素)、第三代(如替加环素)和第四代(如伊拉瓦环素)几乎所有四环素类药物(Jana L.Markley等，2018，Frontiers in Microbiology)。令人担忧的是，近年来不断有新的tet(X)亚型出现(如tet(X1)-tet(X4))，它们所引起的细菌耐药性甚至多重耐药性愈发严重。但针对该类耐药基因及编码酶蛋白的快速检测仍然缺乏有效手段。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)是质谱分析中常用的软电离技术，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，适用于混合物及生物大分子的测定。近年来，该技术已被广泛应用于碳青霉烯酶NDM(Jiajia Yu等，2018，Ann ClinMicrobiol Antimicrob)和脂质A修饰蛋白MCR(Laurent Dortet等，2018，J AntimicrobChemother)的快速检测。

发明内容

本发明为了克服现有技术中的问题，提供了一种检测产四环素类抗生素降解酶细菌的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种检测产四环素类抗生素降解酶细菌的方法，将待测样品与四环素类抗生素标准品的共培养物作为实验组，只含有四环素类抗生素标准品的溶液作为阳性对照组，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法检测；

若实验组中四环素类抗生素特异性离子峰消失，则判定待测样品为产四环素类抗生素降解酶的细菌；

若观察到代表四环素类抗生素的特异性离子峰相对阳性对照组明显减弱，判定该细菌产四环素类抗生素降解酶；

若观察到代表四环素类抗生素的特异性离子峰相对阳性对照组几乎不变，判定该细菌不会产出四环素类抗生素降解酶。

基于四环素降解酶作用机理，本发明创新性地将MALDI-TOF-MS技术应用于Tet(X4)及相关亚型等四环素类抗生素降解酶的快速检测。

优选地，所述四环素类抗生素为四环素、金霉素、土霉素、多西环素、米诺环素、替加环素或伊拉瓦环素中的一种或多种。

本发明同时保护所述的检测产四环素类抗生素降解酶细菌的方法，包括以下步骤:

S1.细菌与药物共培养：将待测细菌进行培养，得到培养液，加入四环素类抗生素标准品溶液，至四环素类抗生素的浓度为140～160μg/mL，混匀后30～40℃条件下孵育6～10h；