[发明专利]一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备的制备方法

说明书

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒的制备方法。通过将I型BVDV的结构蛋白C、E^rns、E1、E2编码基因克隆至pFastBac^TMDual构建pFBD‑BVDV重组杆状病毒穿梭载体，转染昆虫细胞，感染昆虫细胞表达BVDV的结构蛋白C、E^rns、E1、E2，制备由结构蛋白C、E^rns、E1、E2自组装形成的BVDV病毒样颗粒(VLP)。

技术领域

本发明涉及一种牛病毒性腹泻病毒样颗粒、一种牛病毒性腹泻病毒基因重组杆状病毒的制备。

背景技术

牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写 BVDV属于黄病毒科瘟病毒属)引起的牛、羊和猪的一种接触性传染病。牛、羊以消化道黏膜糜烂、坏死，胃肠炎和腹泻为特征，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高；猪则表现为怀孕母猪的不孕、产仔数下降和流产，以及仔猪的生长迟缓和先天性震颤等。一旦感染，可造成持续感染，持续感染牛处于免疫耐受状态时，临床上不表现任何症状，但仍然带毒、排毒，可严重损坏机体的免疫机能，引起牛的生产性能下降，还可以诱发其他病原体的感染而导致继发感染或混合感染等，给养牛业造成了巨大的经济损失，是危害养牛业的主要疫病之一(Yilmaz H，Altan E，Ridpath J，et al.Genetic diversity and frequencyof bovine viral diarrhea virus(BVDV)detected in cattle in Turkey[J].Comparative immunology，microbiology and infectious diseases，2012，35(5):411-416.)。

BVDV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，为正链、单股RNA病毒，全长约12.5kb，基因组只含有一个开放阅读框，编码11种蛋白，其中P14(C)、gP48(E^rns)、gP25(El)、gP53(E2)4个蛋白为病毒结构蛋白，其余为非结构蛋白(Neill J D.Molecularbiology of bovine viral diarrhea virus[J].Biologicals，2013，41(1):2-7.)。E^rns、El、E2三个结构蛋白位于病毒表面，因此组成病毒囊膜结构的三种囊膜蛋白(Uryvaevaev LV， Ionova K S，Dedova A V，et al.Analysis of the cell tissue culturecontamination with the bovine viral diarrhea virus and mycoplasmas[J].Voprosyvirusologii，2012，57(5):15-21.)。其中，E2位于病毒粒子的外表面，含有病毒重要的抗原决定簇，免疫原性最强，是病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生细胞免疫与体液免疫，同时产生保护性的中和抗体 (Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，et al.Vaccinationof cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viral diarrhoea virus majorglycoprotein E2[J].Journal of general Virology， 1999，80(12):3137-3144.)，介导免疫中和反应，参与宿主细胞识别，吸附过程，因此作为诊断抗原具有良好的前景。Bolin SR等早在1996年就利用昆虫细胞表达的BVDV E2 蛋白免疫牛，结果表明，E2蛋白能够有效的保护免疫动物免受同源毒株的攻击(Bolin S R， Ridpath J F.Glycoprotein E2ofbovine viral diarrhea virus expressed in insect cells provides calveslimited protection from systemic infection and disease[J].Archives ofvirology，1996， 141(8):1463-1477.)。Harpin S等用含有E2基因的重组质粒免疫牛，结果表明，免疫动物能够产生特异性免疫应答(Harpin S，Hurley D J，Mbikay M，etal.Vaccination of cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viraldiarrhoea virus major glycoprotein E2[J].Journal of general Virology，1999，80(12):3137-3144.)。Ferrer等利用杆状病毒蛋白表达体系 (Rachiplusia nuperos)获得E2重组蛋白，通过免疫小鼠，该蛋白可诱导中和抗体的产生 (Ferrer F，Zoth S C，CalamanteG，et al.Induction of virus-neutralizing antibodies by immunization withRachiplusia nu per os infected with a recombinant baculovirus expressing theE2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus[J].Journal of virologicalmethods，2007， 146(1-2):424-427.)。