[发明专利]肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物

说明书

本发明公开了一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物，该方法包含：步骤1，设计扩增引物，对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；步骤2，对PCR产物进行纯化；步骤3，设计用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物；第一引物针对单碱基突变位点进行设计；第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端进行修饰，以阻止第二引物的延伸；步骤4，对第一引物及所述第二PCR产物进行单碱基延伸；步骤5，对单碱基延伸反应产物进行纯化；步骤6，对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测。

技术领域

本发明涉及肿瘤驱动基因变异检测技术领域，具体涉及一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物。

背景技术

肿瘤是一种高发病率和高死亡率的疾病，严重危害公众健康。随着对肿瘤发病机制的研究，更多的研究焦点集中在肿瘤驱动基因BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA及微卫星不稳定(microsatellite instablility,MSI)。

RAS基因变异主要为点突变，突变位置以第2、3、4外显子多见，这些密码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白(GAP)的作用位点，突变将会导致Ras-GTP处于持续激活状态，从而引起细胞恶性增殖和转移。其中NRAS突变多发生在第2、3外显子，KRAS突变多发生在第2、3、4外显子。KRAS基因突变与NSCLC对厄洛替尼、吉非替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，KRAS基因突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。因此检测KRAS基因的突变可作为EGFR靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。

BRAF：V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化过程，从而持续激活BRAF蛋白，BRAF蛋白激活后导致MEK/ERK的激活，其通过转录物或非转录物的方式影响肿瘤进展。目前己经发现，在多种人类恶性肿瘤中均存在BRAF基因的突变，如甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膜腺癌等。因此，及时检测BRAF基因突变情况，对早期筛查肿瘤病人以及对肿瘤病人的个体化治疗、预后将具有重要的指导意义。

PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域。其突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶PI3Ks的活性。关于PIK3CA突变这两个热点区的研究发现，激酶区和螺旋区的突变可能通过不同的机制引起酶功能性的改变。不同区域的突变，分别通过与PI3Ks的调节亚单位p85和RAS—GTP相互作用的不同机制导致PI3Ks活化。

临床研究表明，KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因突变的转移性结直肠患者对西妥昔、帕尼单抗等EGFR靶向治疗药物产生耐药，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。目前针对这四个基因突变的检测方法主要是以ARMS-PCR为主“Molecularspectrum of KRAS,NRAS,BRAF and PIK3CA mutations in Chinese colorectal cancerpatients:analysis of 1,110cases Scientific Reports volume 5,Article number:18678(2015)”。突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)是肿瘤个性化分子检测的重要技术。