[发明专利]Mir3061基因Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用

说明书

本发明公开了Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法与应用。所述构建的小鼠基因为Rosa26^LSL/+，本发明首次提供的构建方法，未见任何国内外文献报道。为POF发病机制的研究和药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。本发明还提供了所述小鼠模型在筛选制备检测/治疗生殖发育疾病药物，以及检测/治疗卵巢颗粒细胞的老化和凋亡疾病药物中的应用。本发明方法构建的小鼠模型为生殖发育遗传学和制备检测/治疗卵巢疾病药物以及相关药物筛选提供有效的实验动物模型，有很好的实用价值，并有良好的医学临床应用前景和较大的社会效益。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及利用CRISPR/Cas9技术，获得可进行条件性过表达Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型构建方法与应用。

背景技术

卵巢早衰(POF)是导致女性不孕的主要原因之一，其很大程度上与卵巢颗粒细胞的老化和凋亡直接导致各级卵泡质量下降有关。由于目前缺乏靶向卵巢颗粒细胞转基因小鼠模型，严重制约了POF的机制研究和有效药物的研发。本发明通过RNA-seq高通量测序发现miR-3061在POF小鼠卵巢颗粒细胞内显著降低表达。体外实验也证实，过表达miR-3061会显著促进原代小鼠卵巢颗粒细胞的老化和凋亡。CRISPR/Cas9技术：一种基因编辑技术，通过对靶向基因进行特定DNA修饰，以获取相应的结果的技术。Mir3061基因：microRNA3061基因，microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与生物体转录后基因表达调控。Rosa26：基因Gt(ROSA)26Sor的缩写为Rosa26。本发明进一步研究发现miR-3061与卵巢颗粒细胞存在关联，利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型，成功构建C57BL/6J-Gt(ROSA)26Sor^{em(EF1a-Mir3061)1Smoc}小鼠，对研究卵巢早衰提供了实验动物模型，从而进一步用于筛选制备检测/治疗卵巢疾病药物有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计利用CRISPR/Cas9技术构建Rosa26定点miR-3061基因Cre-loxP条件性敲入小鼠模型及其应用。为POF发病机制的研究和药物设计及药效评价提供有效的实验动物数据。本发明方法所述构建得到的模型的小鼠基因为Rosa26^LSL/+，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，该方法包括如下步骤：

A、确定小鼠5号和3号染色体上的Rosa26基因所在位点为site1如SEQ ID NO：1所示，序列表2，

设计gRNA1的设计识别位点如SEQ ID NO：2所示，序列表3；

B、构建表达gRNA1的表达载体；

C、将步骤B得到的表达gRNA1表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；经长片段PCR鉴定，共获得正确同源重组的F0代小鼠；

D、F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。进一步地，利用CRISPR/Cas9技术构建Mir3061基因的Rosa26定点敲入杂合子小鼠模型的构建方法，步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，序列表4：

P1:atggcgtgttttggttggcgtaag(SEQ ID NO：3)

P2:tttttgggggtgatggtggtc(SEQ ID NO：4)。

步骤C中PCR鉴定的检测引物序列为，P1为序列表4，P2为序列表5。