[发明专利]核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用

说明书

本发明属于基因工程领域，更具体地说本发明涉及一种含有WPRE‑polyA元件的核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用。所述含有WPRE‑polyA元件的核苷酸序列tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因表达载体包括上述的核苷酸序列tWPRE。本发明进一步改进了WPRE‑polyA元件，得到了优化元件tWPRE，同时在质粒转染和病毒感染两方面验证了tWPRE元件的有效性，在扩大载体容量的同时保证了高效的转基因表达效率和病毒感染效率，有助于AAV载体携带更多的特异性启动子和基因，扩大了AAV病毒的作用范围，为基础科研和临床研究提供了一种新的更特异且更高效的表达工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说本发明涉及一种核苷酸序列tWPRE及其基因表达载体和应用。

背景技术

腺相关病毒载体系统(AAV)具有低免疫原性，能感染分裂和非分裂细胞，以及在宿主细胞中维持长程表达，与慢病毒载体系统相比，在实现基因治疗人类疾病中表现出绝对的优势。目前，腺相关病毒载体系统(AAV)在国外已被用于多种基因疗法并进入临床试验，且取得良好效果，如失明、心脏病、肌营养不良、听觉丧失，肺癌、帕金森患者脑部等疾病。同时目前还没有发现任何一例以腺相关病毒载体为基因导入系统的临床试验出现副作用或严重死亡事件等，证明了腺相关病毒载体系统(AAV)的安全可靠性。除了临床应用，AAV载体也在基础研究领域中得到了广泛的应用。

虽然AAV载体具有很多其它病毒载体无法比拟的优势,但是AAV载体包装的常规承载量只有4.2-4.7kbp，不足以携带较大片段的组织特异性启动子或者特定的大片段基因表达，这在一定程度上局限了AAV载体的使用范围。因此，改进AAV载体元件，增加载体容量，有助于AAV病毒载体携带更多的外源核酸物质，为基础科研和临床研究提供更特异，更高效的表达工具。

WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatoryelement)即土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，长度大约600bp，属于顺式作用元件(DNA序列)，由gamma，alpha，beta等三部分构成。WPRE的主要功能如下：1)参与AAV病毒的包装；2)帮助检测AAV病毒的滴度；3)同时有效帮助mRNA的polyA加尾效率，增强转基因的表达和稳定。poly(A)可以终止转录，将poly(A)补加到转录体的3’端，增强RNA的稳定性，提高翻译效率；部分长度的poly(A)对目的基因终止可能没有太大影响，但对蛋白表达可能会有一定影响。

因此，WPRE和poly(A)这两个元件对AAV病毒的包装和基因表达具有重要的作用。有研究报道，保留gamma和alpha部分的WPRE元件可以与SV40poly(A)融合成为只有399bp长度的片段，可以维持AAV病毒的包装和转基因的表达，然而忽略了病毒滴度的检测。因此，如何在不影响病毒包装、滴度检测和表达的前提下，尽可能增大载体容量，扩大AAV病毒的作用范围，仍然有待于进一步研究和改进。

发明内容

本发明公开了一种含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，包括所述tWPRE序列的基因表达载体可在不影响病毒包装、滴度检测和表达的前提下，尽可能的增大载体容量，扩大了AAV病毒的作用范围，为基础科研和临床研究提供了一种新的更特异且更高效的表达工具。

本发明的具体方案如下：

本发明一方面公开了一种含有WPRE-polyA元件的核苷酸序列tWPRE，所述tWPRE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

应该理解，在保持功能不变的情况下，与上述序列(及本发明中的其他序列)具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的序列也在本发明的保护范围之内。所述的序列的差异由碱基的取代、缺失或添加所致，本领域技术人员有能力，例如通过非保守碱基的替换，获得功能相似的序列，这样的序列在本发明的保护范围之内。