[发明专利]一种脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法

说明书

本发明属于疫苗生产技术领域，具体公开了一种脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，本发明采用脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物和白喉CRM197蛋白为原料，采用碳二亚胺EDAC作为交联剂进行偶联，通过衍生物溶液预备、混合配比、结合反应、时效处理、超滤、除菌的工艺进行制备，缩减了工艺流程，有效提高了结合物的多糖收率和蛋白收率，达到降低成本、提高效益的目的。

技术领域

本发明属于疫苗生产技术领域，特别涉及一种脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法。

背景技术

流行性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜发炎的疫症，至今仍未得到有效控制。脑膜炎奈瑟氏球菌主要经由咳嗽，喷嚏或接吻传播，由鼻咽部侵入血循环，最后局限于脑膜和脊髓膜，形成化脓性脑脊髓膜病变。常见的病征包括发高烧、剧烈头痛、后颈僵硬；亦会有嗜睡、呕吐、惧光或皮疹等情况出现。此病可引致脑部受损甚至死亡，病死率较高，维持在5-10％之间，遍见于世界各国，呈散发或大、小流行，以儿童发病率为高。

脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎球菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z十三个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但A、C、W135和Y毒力最强，上述4个血清群占病例数的95％以上，是引起脑膜炎流行最常见的菌株。

荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分，使其免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面的蛋白激活和免疫细胞吞噬。如果细菌被免疫细胞吞噬，荚膜多糖也能够避免细菌被杀灭。荚膜多糖是脑膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，用作流脑多糖疫苗的主要成分，对较大的儿童有一定的保护力。然而，流脑多糖疫苗在2周岁以下的婴幼儿体内所诱生的抗体持续时间短，不能诱导免疫记忆，因此对婴幼儿无持久免疫作用，需要采取多次重复免疫接种，使婴幼儿安渡脑膜炎流行季。

目前，有研究表明，流脑多糖疫苗的荚膜多糖CPS为胸腺依赖性抗原TI-Ag，采用将多糖与蛋白载体偶联，可使胸腺非依赖性抗原TI-Ag转变为胸腺依赖性抗原TD-Ag，从而改变荚膜多糖CPS的抗原性质，可增强免疫原性，诱导出免疫记忆。为此，人们着力于流脑结合疫苗的研制。

现有的流脑结合疫苗在制备过程中，先采用多糖衍生物在交联剂介导下与载体蛋白进行偶联形成稳定的结合物，再对结合物依次进行超滤和纯化，以获得高纯度的结合物。然而，由于各厂家采用的多糖衍生物、载体蛋白、交联剂和制备工艺各不相同，所制备的结合物的多糖收率和蛋白收率亦不同，现有技术的多糖收率和蛋白收率分别为10％和12％左右，存在多糖收率和蛋白收率低、成本高、效益低的问题和不足。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题与不足，本发明的目的是提供一种脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，其采用脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物和白喉CRM197蛋白为原料，采用碳二亚胺EDAC作为交联剂进行偶联，通过衍生物溶液预备、混合配比、结合反应、时效处理、超滤、除菌的工艺进行制备，缩减了工艺流程，有效提高了结合物的多糖收率和蛋白收率，达到降低成本、提高效益的目的。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种脑膜炎球菌荚膜多糖结合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、衍生物溶液预备

将脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物放入烧杯中，采用水浴进行温控，温度控制在4～8℃范围内，搅拌调节pH值，使用0.2mol/L的氯化钠溶液和0.1mol/L的盐酸溶液调节液体的pH值至6.00±0.30范围内，获得衍生物溶液；

步骤二、混合配比

温度控制在4～8℃的条件下，向烧杯内所述衍生物溶液中加入白喉CRM197蛋白，搅拌混合，至烧杯中衍生物溶液的脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物与白喉CRM197蛋白的体积比达到1:0.90～1:2.10，脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的反应浓度在0.5～2.5mg/mL之间，获得平衡溶液；