[发明专利]细菌双杂交纳米抗体筛选系统及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种细菌双杂交纳米抗体筛选系统及其构建方法和应用。所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统由含有LexAWT基因元件的pMHA2质粒和含有LexA408基因元件的pMHN2质粒组成。嵌合型双抑制子LexAWT/LexA408可以联同抗原抗体相互作用抑制下游PsulA‑cI857基因的表达，间接激活P_R‑Kan^R基因的表达，构建严谨高效的纳米抗体阳性筛选系统。候选纳米抗体为合成文库，采用简并引物的方式在CDR3区域引入48个随机碱基并去除了终止密码子以及半胱氨酸密码子。本发明的细菌双杂交纳米抗体筛选系统能够快速、高效、准确地筛选给定抗原的纳米抗体。

技术领域

本发明涉及一种细菌双杂交纳米抗体筛选系统，构建方法及其在纳米抗体筛选的应用，即利用细菌双杂交技术筛选特异性纳米抗体，具体涉及构建细菌双杂交系统与纳米抗体合成文库，并利用细菌双杂交系统筛选特异性纳米抗体，属于生物技术领域。

背景技术

目前，纳米抗体(Nanobody,Nb)作为新型基因工程抗体逐渐成为抗体药物研发中的新兴力量。纳米抗体由骆驼或羊驼等骆驼科动物中特有的“重链抗体”(Heavy-chainantibodies,HCAbs)衍生而来。重链抗体天然缺失轻链，只包含一个重链可变区(Variable domain of heavychain of HCAb,VHH)和两个常规恒定区CH2与CH3。而纳米抗体是单独克隆出重链抗体VHH区域的单域抗体，其长度更是在几个纳米级别，由于其分子质量只有传统抗体的十分之一，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的缺陷。因此，纳米抗体作为一种新型的抗体，显现了其强大的医学价值和市场前景。

目前制备纳米抗体通常采用的方法是噬菌体展示纳米抗体免疫文库以及天然文库，其中免疫文库最为常用。构建免疫文库最为特殊而重要的步骤是免疫骆驼促织骆驼产生特异性重链抗体。免疫文库以及天然文库共同的步骤是，从骆驼血液中分离淋巴细胞，提取总RNA，反转录得到cDNA文库；PCR扩增VHH基因片段并克隆到噬菌粒载体与噬菌体基因III蛋白(GIIIp)融合表达，从而展示在噬菌体表面以供特定的抗原识别筛选。再将重组的噬菌粒载体转化入大肠杆菌细胞并进行文库扩增，从而形成的免疫文库或者是免疫库。噬菌体展示免疫文库最大的缺陷在于针对每一种新抗原都必须重新免疫骆驼并构建文库，工作量大，周期相对较长。此外，在一些特殊情况下，如抗原具有转染性、高毒性、致死性，或是一些免疫原性弱甚至是没有免疫原性的小分子化合物时，动物体内免疫将无法实行。

天然文库作为一种不需要进行骆驼体内免疫就能够实现抗原特异性纳米抗体筛选的文库，已然成为免疫文库的重要补充和支持，是纳米抗体获得的重要文库选择，并且已经被大量应用于纳米抗体的筛选。然而，同免疫文库一样，由于骆驼重链V区胚系基因片段在CDR3结构域重排和位点变异的可控性及建库过程中转化效率不高的因素，一般很难得到具有丰富多样性和较大库容(10⁹Colony-forming units(CFU)以上)的文库(Goldman E R,Anderson G P,Liu J L,et al.Facile Generation of Heat-Stable Antiviral andAntitoxin Single Domain Antibodies from a Semisynthetic Llama Library[J].Analytical Chemistry,2007,78(24):8245-8255.)。此外，天然文库来源的纳米抗体特异性和亲和力相对较低，只有库容足够大时(10⁹-10¹¹CFU)才比较有可能筛选到亲和力高的纳米抗体。

发明内容

针对现有的制备纳米抗体最常用的免疫骆驼方法成本高、库容量小、多样性不够丰富等问题，本发明提供一种基于细菌双杂交的纳米抗体筛选系统，利用嵌合型双抑制子LexAWT/LexA408和抗原抗体相互作用间接激活卡那霉素抗性基因的表达，并结合纳米抗体合成文库的构建，进而实现快速、高效且经济的纳米抗体筛选与制备。

本发明的技术方案如下：