[发明专利]细菌双杂交纳米抗体筛选系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.细菌双杂交纳米抗体筛选系统，其特征在于，包括全长序列为SEQ ID NO.9的重组质粒载体pMHA2和全长序列为SEQ ID NO.13的重组质粒载体pMHN2。

2.根据权利要求1所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统，其特征在于，所述的重组质粒载体pMHA2为将质粒pMS604中的PlacUV5-LexAWT-Fos-colE1-rop基因片段与人工合成的PsulA-cI857和Kan^R-P_R核酸片段组装，形成全长序列为SEQ ID NO.5的质粒pLPK857，再将质粒pLPK857中的LexAWT-Fos基因元件替换成sfGFP-LexAWTDNA合成片段形成的重组质粒。

3.根据权利要求1所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统，其特征在于，所述的重组质粒载体pMHN2为将质粒pDP804中的LexA408-Jun基因元件替换成NbsfGFP-LexA408DNA合成片段形成的重组质粒。

4.根据权利要求2所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统，其特征在于，所述的重组载体pMHA2的构建方法为通过合成sfGFP-LexAWT基因片段，设计引物从质粒pLPK857上扩增pLPK857backbone目的片段，将sfGFP-LexAWT基因片段与pLPK857backbone目的片段连接，得到重组质粒pMHA2。

5.根据权利要求3所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统，其特征在于，所述的重组载体pMHN2的构建方法为通过合成NbsfGFP-LexA408基因片段，设计引物从质粒pDP804上扩增pDP804backbone目的片段，将NbsfGFP-LexA408基因片段与pDP804backbone目的片段连接，得到重组质粒pMHN2。

6.根据权利要求1-5任一所述的细菌双杂交纳米抗体筛选系统在纳米抗体筛选中的应用，其特征在于，具体方法如下：

步骤1：将重组质粒pMHN2中NbsfGFP基因序列替换为纳米抗体保守框架cAbBCII10基因序列，形成全长序列为SEQ ID NO.17的重组质粒质粒pMHC2；

步骤2：利用三核苷酸盒对VHH序列的CDR3区域设计随机简并引物，取代重组质粒质粒pMHC2中cAbBCII10的CDR3序列，并将重组产物电转化大肠杆菌DH10B，构成纳米抗体合成文库；

步骤3：合成目的抗原的DNA片段，并取代重组质粒pMHA2中的sfGFP基因片段，将重组产物电转化步骤2中所构建的纳米抗体合成文库；

步骤4：挑选阳性克隆，测序并表达纯化后进行酶联免疫吸附测试，确定目的抗原的特异性纳米抗体DNA序列。