[发明专利]一种检测miRNA的荧光生物探针及检测方法和用途

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测miRNA的荧光生物探针和检测miRNA的荧光生物传感器及其用途和miRNA的检测方法，利用上述的探针检测miRNA时，具有步骤简单、免标记，反应在等温均相溶液中进行，避免了繁琐的分离过程和耗时的热循环的问题，同时巧妙地结合了催化发夹组装技术和λ外切酶(λ‑Exo)辅助信号扩增技术，同时结合了DNA银纳米簇(DNA‑AgNCs)，实现了生物靶标的高灵敏检测，检测限可低至0.89fM，同时可以区分出miRNA家族成员间的单碱基差异，具有较高的特异性，克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测miRNA的荧光生物探针和检测miRNA的荧光生物传感器及其用途和miRNA的检测方法。

背景技术

microRNAs(miRNAs)是一类短单链非编码RNA，其大小通常为20-25个核苷酸。研究表明，miRNAs高度参与调控多种细胞途径和细胞过程，包括细胞的增殖、分化、衰老和凋亡。同时越来越多的证据表明，miRNAs的异常表达与大部分的人类恶性肿瘤相关，比如肺癌、胃癌、乳腺癌和肝癌等。因此，miRNAs被认为是疾病早期诊断、预后和治疗的潜在生物标志物。miRNAs的快速、准确和高特异性的检测将有助于疾病早期诊断、预后和治疗。然而，由于miRNAs具有体积小、丰度低和家族成员间序列相似度高等特点，使得miRNAs的检测面临较大的挑战。

对于miRNAs的检测，传统方法包括Northern印迹和定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)，是测定miRNAs的金标准。然而，上述的方法存在灵敏度低，特异性差，耗时长和操作复杂等缺陷，大大限制了它们的生物学和医学的应用。因此，新的检测方法一直在持续地开发中，以期实现miRNA的快速、简单和低成本检测，同时具有高检测灵敏度和高特异性。

由于荧光传感器检测具有较低的检测限、灵敏度和特异性，因此，常采用经典的分子信标对生物分子检测。经典的分子信标(MB)设计需要选择合适的荧光染料和淬灭剂，以最大限度地改变荧光发射。然而，荧光染料/猝灭剂与分子信标的结合不仅提高了实验成本，而且大大增加了实验设计的复杂性。为了解决这个问题，DNA银纳米簇(DNA-AgNCs)作为一类新的生物标记引起了人们极大的兴趣。DNA-AgNCs由少量的银原子组成(2-30个原子)，其物理尺寸接近电子的费米波长，具有许多优异的荧光性质，包括良好的量子产率和光稳定性，可调的荧光发射和优异的生物相容性。这些优势使得DNA-AgNCs在核酸检测，蛋白质分析和细胞成像等研究领域得到了广泛的应用。因此，目前，将DNA-AgNCs应用于miRNA的技术也越来越多。

如中国专利文献CN1088663354A中公开的一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用，通过加入目标物miRNA，与互补miRNA部分碱基互补配对的发夹DNAHP1被打开和目标物结合，形成目标物与发夹DNA H1的杂交链，在加入与发夹DNA HP1碱基互补配对更多的发夹DNA HP2以后，目标物miRNA的加入可引发这个催化发夹自组装放大系统，利用以DNA为模板形成的银纳米簇的电致化学发光信号检测目标物，其最低检测限可低至1am。然而在上述方法中，需要使用玻碳电极，在检测过程中包括对电极修饰金纳米粒子、对电极修饰单链DNAS1、对电极修饰6-巯基-1-己醇、对电极修饰HP1-HP2等步骤，步骤过多，操作复杂，效率低，且检测过程中需要的材料、设备、试剂等较多，成本较高。

发明内容

因此，本发明要解决的第一个技术问题在于克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题，从而提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的用于检测miRNA的荧光生物探针。

本发明要解决的第二个技术问题在于克服现有技术中的miRNA检测方法不能同时兼顾快速、简单和低成本，同时具有高检测灵敏度和高特异性的问题，从而提供一种快速、简单、低成本、高检测灵敏度和特异性的检测miRNA的荧光生物传感器。