[发明专利]粪肠球菌、其培养基及牛奶中抗生素残留的检测方法及应用

权利要求书

1.一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，于2016年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12088。

2.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的应用。

3.权利要求1所述的粪肠球菌在筛检牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的培养基配方，其配制步骤为：

配制配方1：蛋白胨30g，酵母提取物30g，牛肉浸膏10g，可溶性淀粉1.0g，葡萄糖40g，氯化钠10g，K₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 6g，用1000mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0-7.5，包装后121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用；

配制配方2：称取优质黄豆粉200g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮沸30分钟后，用多层纱布及定性滤纸过滤；

配制配方3：取150mL按配方2配制的滤液，加入50mL按配方1配制的液体，调节pH至7.0-7.2，121℃高压灭菌20-30分钟，冷却后置4℃保存、备用。

4.一种牛奶中残留四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素中的检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将权利要求1所述的粪肠球菌菌株接种于LB固体培养基，40℃-42℃培养18-24h；

(2)菌悬液制备：取步骤(1)所得的粪肠球菌单个菌落，用无菌生理盐水，调节OD600nm为0.10-0.12的菌悬液；吸取0.1ml菌悬液加入到按配方3配制的9.9m l培养基中，42℃培养过夜，过夜培养物置于4℃保存；

(3)取过夜培养物，用无菌生理盐水配制成1:10的工作用菌悬液，临用新配；

(4)标准管制备：取四环素、红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素、氯霉素标准储备液，用pH8.0磷酸盐缓冲液稀释配制成不同浓度的抗生素标准工作液；四环素300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的标准工作液；红霉素160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；氨苄青霉素20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的标准工作液；庆大霉素800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L的标准工作液；万古霉素400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的标准工作液；氯霉素400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的标准工作液；4℃冷藏备用；

(5)样品准备：取样品原料乳10mL于无菌试管中，85℃水浴15-20分钟，5000rpm离心5分钟，弃上清；

(6)样品检测：选择300μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L的四环素，160μg/L、80μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的红霉素，20μg/L、10μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L的青霉素标准品溶液，800μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L庆大霉素标准品，400μg/L、200μg/L、150μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L的万古霉素标准工作液；400μg/L、300μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L、40μg/L、20μg/L、10μg/L的氯霉素标准工作液，溶液为快速筛检阳性对照管指示管，以0μg/L为阴性生长对照指示管，取步骤(5)所得的样品，按配方3所得的培养基中，混匀后放入42℃培养3小时，取出直接观察凝固现象，或加入0.02％甲基红指示剂观察颜色变化。