[发明专利]一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具

说明书

本发明公开了一种在‑80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。其中，方法包括S1、将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min；S2、首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液、间隔空气柱和混合有胚胎的保存液等；S3、将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，再将麦管传热容器置于盛装有乙醇溶液的真空保温容器中，使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；S4、将真空保温容器迅速放置于‑80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。本发明通过对保存处理液的成分及配比的改进和利用及优化保存方法步骤形成了一种全新地且适用于将玻璃化冷冻胚胎保存于‑80摄氏度的冰箱中的模式，方便在实验室内对胚胎进行便捷的取用、操作及移植。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法和器具。

背景技术

辅助生殖技术是一种集胚胎分割、嵌合、移植、体外受精、转基因等技术于一体的综合性技术，不但是动物繁殖领域的重要技术革命，也是治疗人类不孕不育的重要技术手段，利用此技术可以充分挖掘动物的遗传和繁殖能力、增加纯种家畜和优秀个体的后代数量、缩短家畜的改良周期以及保存具有优良遗传特性的胚胎和基因，在生物学及医学领域的被广泛地研究和应用。

近些年来，人类不孕不育已经成为继癌症、心血管病之后的第三大疾病。部分患者不得不借助于人类辅助生殖技术来解决生育问题，还有部分肿瘤患者非常需要在癌症治疗之前保留生育能力，经济动物胚胎的胚胎移植以及重要物种的种质资源保存等等。

目前，业内最常用的胚胎保存方法是玻璃化保存方法，所谓的玻璃化保存方法即是指将胚胎置于高浓度的保存液中进行短时间处理，然后再快速移放于液氮中进行冷冻保存的方法。而通过玻璃化保存方法来保存的胚胎，其细胞内外的水分不会形成结晶，使细胞结构不会受到破坏而得以存活；这种方法操作简单，因此获得了广泛的应用。然而，此方法存在的一个最大缺陷在于：冷冻保存的胚胎必须放在液氮温度中才能维持胚胎复苏后的成活率，这给胚胎的解冻和运输都带来了严格的要求，无法满足胚胎移植及实验研究的需要。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法；本发明的第二个目的在于提供一种适用于此方法的保存玻璃化冷冻胚胎的器具。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种在-80度冰箱中保存玻璃化冷冻胚胎的方法，它包括以下步骤：

S1、胚胎预处理：将获取的胚胎置于平衡液中处理至少2min，取出并移置于保存液处理至少1min，其中，按质量摩尔浓度计，平衡液由0.3mol/kg磷酸缓冲盐溶液、11.0mol/kg乙二醇、0.7mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；按质量摩尔浓度计，保存液以HTF培养基为基础液由24.6mol/kg乙二醇、3.1mol/kg蔗糖和0.0062mol/kg聚蔗糖混合而成；

S2、胚胎入管：按一定长度首先向无菌麦管中置入蔗糖培养液，然后间隔地且顺序地置入间隔空气柱和混合有胚胎的保存液，最后将无菌麦管的两个端口作密封处理；

S3、胚胎预冷冻：首先将经过密封处理的无菌麦管封装于麦管传热容器内，随后再将麦管传热容器置于真空保温容器中，最后将乙醇溶液填充于真空保温容器内并使麦管传热容器位于乙醇溶液的液面内；

S4、胚胎保存：将真空保温容器迅速放置于-80摄氏度的冰箱内，即可完成冷冻胚胎的保存。

优选地，在完成步骤2后并执行步骤3之前的期间内，将无菌麦管置于液氮中作临时保存处理。

优选地，在步骤S2中，对容积为0.25ML的麦管作紫外线照射消毒处理以获得无菌麦管，置入的混合有胚胎的保存液的长度为2cm。