[发明专利]基于DNA-铜纳米簇构建的DNA相关酶电化学生物传感器及其应用

说明书

本发明公开了基于DNA‑铜纳米簇构建的电化学生物传感器及其应用，具体步骤如下：(1)巯基DNA修饰裸金电极(Au)表面，记为Electrode1；(2)取3‑吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液、5×TdT缓冲液、dTTP和TdT制备TdT反应液，滴于Electrode 1表面，在37℃下放置0.5～1.5h，记为Electrode2；(3)向Electrode2中电极表面滴加Cu²⁺，室温孵育10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极。然后向电极表面滴加抗坏血酸钠溶液，室温反应10～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，记为Electrode3，于PBS(0.1M，pH7.0)电解质溶液中检测电化学响应。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，并且可以同时检测两种酶的活性及其小分子抑制剂。结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器及其检测方法，尤其是涉及基于DNA-铜纳米簇构建的DNA相关酶电化学生物传感器及其应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

遗传物质的稳定传递是生命繁衍的根本。基因组DNA的精确复制和分配是遗传物质传递的基础，也是细胞周期两大最核心的生物学事件。DNA相关酶是复制过程中最重要的因子之一。尽管对这类酶的研究已有将近60年的历史，但依然是生命科学基础研究的前沿之一。它们不仅参与正常基因组DNA合成过程，也参与DNA损伤情况下多种修复过程。最近的肿瘤细胞比较基因组数据表明，多种DNA相关酶基因突变与某些肿瘤和遗传疾病相关。因此，对DNA相关酶的研究能够为这些疾病致病机理研究与诊治提供新思路和新方法。

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)能够通过将脱氧核糖核苷酸等温和重复添加到DNA分子的3′-OH末端来催化具有三个或更多个核苷酸长度的DNA的延伸。TdT仅在未成熟淋巴细胞和急性淋巴细胞白血病细胞中表达，因此TdT是急性白血病的常规诊断的重要生物标志物。此外，TdT被广泛用作分子生物工具，用于标记DNA末端，快速扩增互补DNA末端和凋亡细胞检测。因此，测定TdT活性和抑制，在临床诊断，生物医学研究，和相关的药物的发现有重大意义。传统的TdT活性测定依赖于生化测定，免疫测定或凝胶电泳分析。然而，这些分析需要放射性或荧光标记的DNA或核苷酸以及抗体的制备，耗时、昂贵且劳动强度大。因此，开发简单、快速、灵敏的TdT测定方法仍然是一个巨大的挑战。

核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。其中，核酸外切酶I(Exo I)是一种仅能从单链DNA链的3′端到5′端，按照碱基顺序，逐个催化水解碱基间的磷酸二酯键，逐渐降解单链DNA的酶。核酸外切酶在许多生物学过程中起重要作用，如DNA复制、重组、修复等。其中最重要的功能就是维持生物体内的基因突变几率，从而维持遗传信息的稳定性。目前对Exo I的活性检测普遍缺乏定量描述，因为传统检测Exo I活性的方法是将标准DNA与核酸外切酶反应，凝胶电泳观察酶切效果，这种方法最多给出半定量结果，且操作麻烦、重现性差，不能实时给出不同条件下的酶活性变化。因此，发展一种快速、准确、灵敏的定量检测Exo I活性的方法，将有重要价值。

本发明基于DNA模板化的铜纳米簇(简写CuNCs)，发展了一种新型电化学生物传感器，用于TdT和Exo I的活性检测。首先，利用TdT对基底DNA的延长和抗坏血酸钠的还原，形成DNA模板化的CuNCs，成功制备TdT电化学生物传感器；而Exo I的加入导致CuNCs无法形成，可以成功制备Exo I电化学生物传感器。利用方波伏安法，通过CuNCs的溶出作为电化学信号，根据TdT和Exo I活性对电化学信号的影响，实现TdT和Exo I活性的定量检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于DNA-铜纳米簇构建的DNA相关酶电化学生物传感器及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于DNA-铜纳米簇构建的DNA相关酶电化学生物传感器及其应用，具体步骤如下：