[发明专利]一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法

说明书

本发明公开了一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：1)材料的灭菌：2)将丝素蛋白溶液、改性透明质酸溶液混合形成预聚物溶液，向预聚物溶液中加入光引发剂；3)超声处理步骤2)所得的预聚物溶液，超声后溶液具有流动性且呈半透明状；4)经步骤3)处理所得溶液与细胞混合均匀得细胞预聚溶液，进一步将细胞预聚溶液加入细胞培养板中；5)将步骤4)所得培养板放在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至预聚溶液变成乳白色后即制得。利用本方法能够实现细胞在高强、高韧的双网络水凝胶中的三维培养，有利于类似软骨等承重软组织组织在体外的三维构建。

技术领域

本发明属于组织工程生物材料领域，具体涉及一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法。

背景技术

在水凝胶类材料是一种具有高度吸水性和保水性，质感柔软的具有三维网络体系的聚合物，与活体软组织质感相近；因其三维网络结构与天然细胞外基质相近，利于种子细胞的存活；可在液态时微创注射至体内再形成半固态的胶体从而减少植入创伤等独特优势，已广泛应用于组织工程中支架类材料的研究。但水凝胶存在力学性能较差以及降解速度过快等缺点,导致其难以用于承重承力的软骨组织的三维构建。因此，如何提高水凝胶的力学强度成为国内外专家学者共同面临的难题之一。

近年来，双网络水凝胶材料由于其具有优良的拉伸性能和更高的机械强度受到了研究人员的广泛重视。双网络水凝胶是由两种不同性质的聚合物形成的互穿网络，第一层为高度交联的刚性聚合物网络，第二层为松散交联的软且韧的中性网络，其中，刚而脆的网络提供高强度的弹性模量，而软而韧的网络可使材料产生大形变从而保证其高韧性。在受到外力作用时，两层网络相互配合，吸收并耗散外界应力，从而达到提高水凝胶强度的目的。由两种不同性质的聚合物通过交联改性形成的双网络水凝胶具有极高的机械强度和韧性，甚至可以和橡胶材料相媲美。然而，当前制备双网络水凝胶的方法大多使用了有毒的交联剂,或者成胶时间过长,难以实现细胞的体外三维装载，不能满足软骨等组织在体外的三维构建的要求。

因此，如何找到一种绿色无毒、快速的成胶方法，并优化双网络水凝胶的制备流程，是实现双网络水凝胶体外细胞三维装载的关键。

发明内容

针对现有双网络水凝胶制备技术的缺陷，本发明提供了一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，所述方法能有效避免有毒交联剂的引入，不会对凝胶中的细胞造成毒害，而且能够实现快速凝胶化，有利于软骨等承重软组织在体外的三维构建。

为实现上述发明目的，具体提供了如下技术方案：

一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)使用高温高压法对丝素溶液和改性透明质酸溶液进行灭菌处理；

2)将丝素蛋白溶液、改性透明质酸溶液按混合形成预聚物溶液，并添加光引发剂；

3)超声处理步骤2)所得的预聚物溶液，超声后溶液具有流动性且呈半透明状；

4)将经步骤3)所得溶液与细胞混合均匀得到细胞预聚溶液；

5)将细胞预聚溶液加入细胞培养板中，在紫外光下进行光交联成胶，然后放置在37℃恒温箱中，至预聚溶液变成乳白色后即制得。

优选的，步骤1)所述丝素蛋白依次采用了脱胶、溶解、透析、浓缩的分离提纯工艺，所述改性透明质酸溶液为甲基丙烯酸酐改性透明质酸溶液。

进一步优选的，步骤1)所述丝素蛋白的质量体积分数为8％，所述改性透明质酸溶液的质量体积分数为2％，所述丝素蛋白溶液与改性透明质酸溶液的添加质量比例为8.6～9.5：1.4～0.5，所述光引发剂与预聚物溶液的质量体积比(g/ml)为0.5％。

优选的，步骤1所述高温高压的条件为120℃、0.25MPa,灭菌时间为20min。