[发明专利]鳕鱼皮寡肽及其分离纯化方法和在制备ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂及抗Ⅱ型糖尿病药物中的应用

说明书

本发明公开了一种鳕鱼皮寡肽及其分离纯化方法和应用，该鳕鱼皮寡肽的氨基酸序列分别为Glu‑Gly‑Gly‑Tyr‑Thr‑Arg、Tyr‑Val‑Arg或Phe‑Tyr‑Glu。分离纯化方法包括：以阿拉斯加狭鳕鱼皮为原料，蛋白酶酶解法制备鳕鱼皮胶原肽混合肽；再依次进行超滤处理、葡聚糖凝胶色谱柱粗分以及高效液相色谱分离；葡聚糖凝胶色谱柱由葡聚糖凝胶树脂Sephadex G‑25和葡聚糖凝胶树脂Sephadex G‑50串联而成。经活性试验发现，该三种鳕鱼皮寡肽具有ɑ‑葡萄糖苷酶抑制活性，能辅助降血糖，可用于制备抗Ⅱ型糖尿病药物。

技术领域

本发明涉及鱼皮寡肽的分离纯化及应用领域，尤其涉及阿拉斯加狭鳕鱼皮寡肽及其分离纯化方法和在制备ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂及抗Ⅱ型糖尿病药物中的应用。

背景技术

阿拉斯加狭鳕鱼。学名为Theragra chalcogramma，生活在大西洋北部，是一种冷水性深海鱼类，肉质细嫩，肉味清淡，由于其长期的生长环境特殊(低温、高压)，其鱼蛋白(鱼肉、鱼皮等)的氨基酸组成及氨基酸序列可能有别于其他的浅海鱼及淡水鱼等。

鳕鱼皮胶原肽是以鳕鱼皮为原料，利用酶法制得而成的一类蛋白质、多肽、寡肽和氨基酸的混合物(含量以寡肽为主)。其中的寡肽是一类氨基酸残基数目在2～12个的小肽。

如申请公布号为CN 108530530 A的中国专利文献中公开了一种鳕鱼鱼皮胶原肽的制备方法，包括：1)将鱼皮除杂清洗后粉碎成浆，经酸洗、碱洗后再水洗至中性；2)将步骤1)处理后的鱼皮加入热水中保温；3)将步骤2)得到的蛋白提取液中加入蛋白酶，经两次酶解处理；4)将酶解后的浆液用离心机除去固体残渣，所得清液经超滤膜去除少量大分子杂质，再用纳滤膜去除无机盐和小分子杂质并浓缩，得到鱼皮胶原肽溶液，经喷雾干燥得到鱼皮胶原肽粉末。

再如申请公布号为CN 104152518 A的中国专利文献中公开了一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括：(1)鳕鱼皮预处理；(2)酶解反应：加入胰蛋白酶酶解反应；(3)超滤得GM2组分；(4)DEAE-SepharoseFF离子交换层析分离得到GM2-2组分，冷冻干燥得到胶原蛋白酶。

但以上技术方案得到的胶原肽或胶原蛋白酶均属于大分子肽或蛋白质，其分离方法不适用于鳕鱼皮寡肽的分离纯化。

分子量较小的鳕鱼皮寡肽之间分子量较为接近，而且其他物性如带电性、疏水性等差别不明显，利用传统膜分离方式或采用单一填料的层析分离法无法分离生物活性较高的组分。

目前已报道的鱼皮寡肽的生物活性有抗氧化、降血糖、提高免疫功能等，如WANG等(WANG T Y,HSIEH C H,HUNG CC,et al.Fish skin gelatin hydrolysates asdipeptidyl peptidase IV inhibitors and glucagon-like peptide-1stimulatorsimprove glycaemic control in diabeticrats:a comparison between warm-and cold-water fish[J].)对比目鱼和罗非鱼的鱼皮进行水解，经分离纯化后得到一种二肽基肽酶，发现其可以促进胰高血糖素样肽和胰岛素的分泌，进而发挥调节血糖的作用。

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。降糖药按照降糖机理大致分为三种：(1)刺激胰岛素的分泌或胰岛素制剂，如磺脲类药物；(2)增加外周组织对葡萄糖的利用，如双胍类降糖药；(3)ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂，如临床上常用的阿卡波糖等。

目前公开的具有降血糖功效的鱼皮寡肽均是遵循机理(1)发挥调节血糖的作用，还未有公开其它的降糖机理。

发明内容