[发明专利]一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用

说明书

本发明公布了一种基于CRISPR/Cas和lambda Red重组系统的体内质粒编辑系统及其应用。所述体内质粒编辑系统包括：HsdR功能缺失且基因组中整合有可诱导表达的λRed重组蛋白基因和可诱导表达的Cas蛋白基因的大肠杆菌工程菌株，插入靶标序列的crRNA表达质粒，以及等位交换底物和靶标质粒。本发明将CRISPR‑Cas系统与重组工程整合使用，建立一种快速且无痕的体内质粒编辑方法，可方便快捷地在大肠杆菌中对质粒进行基因删除、点突变和片段插入，以及建立质粒突变库。

技术领域

本发明涉及质粒编辑系统，特别涉及一种用于体内改造质粒的CRISPR/Cas和λRed重组系统。

背景技术

重组工程是一种基于核酸同源重组原理的生物技术，利用噬菌体重组蛋白来促进由单链DNA(ssDNA)或线性化双链DNA(dsDNA)介导的体内同源重组。目前，已被广泛应用于多种原核生物的基因组DNA、BAC以及质粒DNA的改造，包括突变、删除或者插入。但是，该技术存在重组效率较低的问题，需要添加筛选标记(如抗生素)来筛选重组子，而后去掉筛选标记则需利用两步法或引入序列特异性重组酶切除抗性标签(抗性基因两边有同向的两个短的DNA序列可以被特定的重组酶识别)，切除后仍会留下一个短的能够被重组酶识别的DNA序列。这使重组操作更复杂且耗时长，很难得到一个真正的无痕突变株。为解决重组效率低以及实现无痕改造细菌基因组DNA，重组工程偶联CRISPR-Cas系统是一种简单有效的方式。

RNA引导的CRISPR-Cas核酸内切酶系统，作为原核生物的一种获得性免疫系统，当前已成为一种高效的基因编辑工具。Cas12a(亦称为Cpf1)，属于II类V型CRISPR系统内切酶，是一种双重核酸酶，可切割RNA使之形成成熟的向导crRNA，亦可识别PAM区(5’-YTN-3’)并在crRNA引导下切割靶向DNA。CRISPR-Cas12a系统被广泛应用于对细菌、植物以及哺乳动物等诸多物种进行基因编辑。我们已利用CRISPR系统偶联λRed重组系统在大肠杆菌、鼠疫杆菌以及分枝杆菌中实现基因编辑操作。

质粒，作为一种非常有用的工具，常用于研究细胞基因组信息以及表达异源基因和信号通路基因。随着分子生物学技术日益发展，已有许多方法可用于体外、体内质粒克隆，甚至大片段克隆也不再是难题。但是，对大质粒进行遗传操作，比如点突变、删除、替换以及插入，仍很困难。基于重组工程的质粒编辑技术可以有效地解决上述问题。该方法可对质粒进行定点精准改造，勿需考虑是否存在限制性内切酶位点。但是，由于重组效率低下，常利用筛选标记或反向筛选元件来筛选重组子。而且，多聚体质粒的形成以及同一细胞内重组质粒和原始质粒的并存问题也限制该方法的应用。

发明内容

针对传统同源重组系统构建质粒过程中存在的上述问题，本发明旨在建立一种高效的体内质粒编辑系统和方法，可方便快捷地实现删除、点突变、替换及片段插入，并能够应用于突变文库的建立。

为实现本发明目的，本发明首先提供一种用于质粒编辑的大肠杆菌工程菌株，所述工程菌株HsdR功能缺失，且在其基因组中整合有可诱导表达的λRed重组蛋白基因和可诱导表达的Cas蛋白基因。

在本发明的一个实施例中，提供了一种上述大肠杆菌工程菌株SY4539，其构建如图1所示，通过同源重组方法将阿拉伯糖启动子及其调控的基因Cas12a整合至大肠杆菌DY331基因组，进一步利用基因敲除方法in-frame删除hsdR。

上述λRed重组蛋白含Gam、Beta和Exo蛋白，这三个蛋白共同介导双链DNA等位交换底物的同源重组，其中Beta蛋白介导单链DNA等位交换底物的同源重组。优选的，上述λRed重组蛋白可由温度敏感启动子驱动表达。

所述Cas蛋白，可为Cas9、Cas12a等，例如在本发明实施例中为Cas12a。优选的，所述Cas蛋白可以在阿拉伯糖启动子的驱动下进行表达。

HsdR的功能缺失导致菌株细胞内的I型限制酶EcoK活性缺失，以利于外源DNA导入及质粒转化。