[发明专利]一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交染色体制片的处理方法

说明书

本发明公开一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交染色体制片的处理方法，包括风信子染色体制片和染色体制片处理，重点解决了风信子利用现有荧光原位杂交技术很难检测到清晰杂交信号的缺陷。风信子属植物根尖含有多糖、多酚等次生代谢物，水培风信子根系直径约1.5‑2.0 mm，分生区域被较厚的表皮细胞包裹在根尖中部，因此压片时杂质较多，获得的染色体制片直接用于FISH杂交，很难检测到清晰的杂交信号，本发明通过酶处理染色体制片后再进行FISH杂交能够捕捉到微小但清晰的信号。本方法处理的风信子属根尖染色体制片适用于45S rDNA探针、5S rDNA探针、18S rDNA探针、端粒探针等FISH杂交。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交染色体制片的处理方法。

背景技术

荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybrization，FISH) 是在 20 世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，能够将与探针互补的 DNA 序列直观的定位到染色体上，并且寡拷贝的探针还能够锚定在单一的染色体上，不仅提高了实验的灵敏度，还大大缩短了实验周期。 目前，该方法已经广泛应用于遗传作图、转基因定位、染色体畸变检测、基因组结构和物种进化分析等方面。FISH技术已在很多植物上运用成功，但是，球根花卉含有较多的多糖、多酚等次生代谢物，根尖分生区杂质较多，目前关于百合、石蒜、郁金香等球根花卉的荧光原位杂交研究较为成熟，但风信子属植物水培根尖含有较多杂质，染色体制片直接用于荧光原位杂交技术无法获得清晰的杂交信号。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于风信子属荧光原位杂交染色体制片的处理方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交染色体制片的处理方法，包括以下步骤：

（1）风信子染色体制片；

（2）染色体制片处理。

上述方法中步骤（1）中染色体制片的步骤为：

（1）选取水培风信子根尖，当水培根系长达1 cm时，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10 ml盛有预处理液的离心管中，进行预处理；

（2）预处理液由0.2％秋水仙素与0.002 M 8-羟基喹啉混合液1:1配制而成，处理20 h后转至卡诺氏固定液I（无水乙醇：冰乙酸=3:1）固定24 h，4℃贮存备用；

（3）随机选取风信子品种各10条根，45%乙酸解离1.5-2 h；

（4）45%乙酸压片；

（5）Olympus BX41相差显微镜镜检，选取分裂相较好的染色体制片备用；

（6）揭片：①冷冻揭片（超低温冰箱-70℃冷冻过夜）；②液氮揭片（液氮处理30秒），揭片后立即放入无水乙醇脱水半小时以上，气干，室温贮藏备用。

上述方法中步骤（2）中染色体制片处理液配制的步骤为：

（1）RNA酶A：浓度25mg/mL，用1×TE 进行溶解，-20℃保存，使用前用2×SSC进行稀释；

（2）4%胃蛋白酶：用0.1 mol/L HCl进行溶解，4℃保存，使用前用0.1 mol/L HCl稀释；

（3）4%多聚甲醛：ddH₂O 900µl和1mol/L NaOH 500µl加热至65～70℃，加入多聚甲醛40 g，加热并搅拌直到充分溶解，冷却至室温，加入100 µl 10×PBS，加HCl调至pH7.3，抽虑灭菌后分装，4℃避光保存。