[发明专利]一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，具体的，本发明公开了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9‑N‑shRNA3质粒和辅助质粒共转染AAV‑293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；所述干扰片段序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ ID NO.8所示；所述AAV2/9‑N‑shRNA3质粒，由经BamHI和EcoRI双酶切的pHBAAV‑U6‑CMV‑ZsGreen载体与干扰片段基因连接、转化后构建而成，并研究AAV2/9‑N‑shRNA3对预防犬瘟热的效果。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。据报道，43个国家、272种不同的动物可以通过自然途径或者试验感染犬瘟热病毒。在自然条件下，犬瘟热病毒能够使犬科(狗、狐狸、豺、狼)、鼬科(鼬鼠、雪貂、水貂、水獭等)、浣熊科(浣熊、熊猫)、猫科动物(如狮子、东北虎、远东豹)等多科动物以及海狮和猴发生感染。敏感动物感染犬瘟热病毒后，典型症状是双相热，并出现抽搐、口吐白沫等神经症状和不同程度的胃肠炎、卡他性肺炎。在自然条件下，犬瘟热病毒通过上呼吸道和飞沫传播，发病率几乎达100％。其高发病率、高死亡率的流行特点对毛皮动物养殖业、珍稀动物及野生动物保护都造成了巨大损失。尤其是犬瘟热病毒可以感染灵长类动物，给人们以警示，犬瘟热病毒有可能发展成为能感染人的新病毒。

弱毒疫苗被广泛应用于预防犬和其它动物犬瘟热，然而，但被免疫动物不能得到完全保护，许多国家均有免疫群体暴发犬瘟热的报道，而且弱毒苗的使用，会在临床上带来散毒风险以及毒力返强的风险，临床上也不能通过抗体检测来鉴别野毒感染和疫苗免疫。因此，临床上亟需一种新型、安全、有效的生物制剂来预防犬瘟热。RNA干扰(RNAinterfernce，RNAi)的功能性中间分子—小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)可引导一种内切酶复合物剪切有同源序列的靶mRNA，导致mRNA降解，从而引起转录后基因沉默机制，干扰基因表达。该技术能对抗病毒所表达mRNA等外源基因的侵害，尤其是以病毒载体表达发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，具有特异、高效和持久的特点。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生活周期需要辅助病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)参与，接种动物后一过性感染，不会在动物体内复制，不会污染环境，没有潜在散毒危险，而且迄今从未发现野生型AAV对人体致病，重组AAV基因组序列上去除了大部分的野生型AAV基因组元件，进一步保证了安全性；AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验，能介导基因的长期稳定表达(可达半年以上)，具有表达时效长的优点，因此构建CDV shRNA腺相关病毒，用来预防犬瘟热，可以解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。

发明内容

本发明通过重组腺相关病毒技术，构建shRNA重组腺相关病毒，来预防犬瘟热，解决现阶段弱毒疫苗存在的安全性问题。

本发明提供了一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到shRNA重组腺相关病毒；

其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQID NO.8所示；

所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV-RC9质粒和pHelper质粒。