[发明专利]一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒

权利要求书

1.一种预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，由AAV2/9-N-shRNA3质粒和过表达质粒、干扰质粒共转染AAV-293细胞后得到预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒；

其中，所述AAV2/9-N-shRNA3质粒是将干扰片段重组至pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体得到的，所述干扰片段的序列的Top strand如SEQ ID NO.7所示，bottom strand如SEQ IDNO.8所示；

所述过表达质粒、干扰质粒分别为为pAAV-RC9质粒和pHelper质粒。

2.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen载体经BamHI和EcoRI双酶切后，与干扰片段基因连接后得到所述AAV2/9-N-shRNA3质粒。

3.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，AAV2/9-N-shRNA3质粒的构建方法，包括如下步骤：

S1.人工合成干扰序列shRNA3：

Top strand：

gatccgccagtgaagagagttctcctgtctattcaagagatagacaggagaactctcttcactggttttttc

bottom strand：

aattgaaaaaaccagtgaagagagttctcctgtctatctcttgaatagacaggagaactctcttcactggcg

S2.引物退火形成带粘性末端的双链片段

将单链的引物退火成双链oligo序列，退火程序：95℃ 10min，75℃ 10min，55℃10min，35℃ 10min，15℃ 10min；

S3.用限制性内切酶BamHI和EcoRI对载体pHBAAV-U6-CMV-ZsGreen进行双酶切，双酶切完成后，胶回收；

S4.将S2得到的退火产物和S3经过酶切的载体进行连接得到连接产物，即可得到AAV2/9-N-shRNA3质粒，转化至感受态细胞，备用。

4.根据权利要求3所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，S4中的连接反应体系如下：退火产物1μl，酶切好的载体100-200ng，ligase buffer 2μl，T4ligase 1μl，H₂O补齐至20μl，以上连接反应体系在16℃过夜。

5.根据权利要求3所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，S4中的转化步骤包括：将连接产物以Cacl₂方法转化加入感受态细胞，于Amp抗性平板，37℃条件下培养过夜，得到转化后的N shRNA3，；转化后的N shRNA3平板挑菌，于37℃条件下、250转/分钟，摇菌14小时，挑取阳性克隆子，保存备用。

6.根据权利要求4所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌菌株stbl3感受态细胞。

7.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，所述共转染的反应体系如下:转染100mm平皿所需的转染复合物成分如下：10μL过表达质粒+20μLpHelper质粒+10μL AAV2/9-N-shRNA3+150μL转染试剂。

8.根据权利要求1所述的预防犬瘟热的shRNA重组腺相关病毒，其特征在于，转染AAV-293细胞的转染试剂为Lipo转染试剂。