[发明专利]一种佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。佐匹克隆人工半抗原的分子结构式如式(Ⅰ)，佐匹克隆人工抗原的分子结构式如式(Ⅱ)。所述应用是所述佐匹克隆人工抗原在制备抗佐匹克隆抗体中的应用。本发明的佐匹克隆人工半抗原最大程度地保留了佐匹克隆的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的佐匹克隆人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗佐匹克隆抗体，经免疫新西兰白兔获得的免疫血清的效价高达1∶70000，可用于对佐匹克隆进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

背景技术

佐匹克隆(Zopiclone)作为第三代镇静催眠药物，它既能够缩短睡眠潜伏期、增加慢波睡眠、延长睡眠时间、提高睡眠质量以及睡眠深度、减少夜间觉醒和早醒次数，又不会引起精神运动性障碍。佐匹克隆具有抗焦虑、抗肌肉松弛和抗惊厥等作用，次日晨时残余作用低，清醒后无宿醉反应，可用于各种原因引起的失眠，尤其适用于入睡困难和睡眠维持困难的患者。本品口服吸收快，半衰期为3.5～5小时，连续多次给药无蓄积作用；具有高效、低毒、成瘾性小的特点。

然而经调查报告显示，服用佐匹克隆也会伴随着一定的不良现象，比如服药当夜会对患者造成不同程度的记忆损伤、运动损伤和行为损伤、次日思睡、次日神运动性损害、不同程度的药物依赖和滥用、口苦、急性闻质性肾炎、致畸、乳汁中含量太高和中毒等。

目前，对佐匹克隆的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速、准确的要求。因此建立快速、灵敏、准确的检测技术是很有必要的。

免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的关键是能够制造出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体。但是，由于包括佐匹克隆在内的大多数小分子化合物(分子量小于1000)，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，故小分子物质被称为半抗原。通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位置上带上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，生成半抗原-载体偶联物(即人工抗原)，人工抗原可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。

现有技术中还未有佐匹克隆人工半抗原、人工抗原的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种佐匹克隆-牛血清蛋白人工抗原的制备方法，所制备的佐匹克隆-牛血清蛋白人工抗原可进行动物免疫，取得相应的佐匹克隆抗体，可用于各种佐匹克隆类免疫分析法的研究，为佐匹克隆的检测提供更加方便快速准确的途径。

本发明首先提供了一佐匹克隆人工半抗原，该佐匹克隆人工半抗原最大程度的保留了佐匹克隆的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇。

一种佐匹克隆人工半抗原，其分子结构式如(Ⅰ)所示：

本发明公开了一种佐匹克隆人工半抗原的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氢-7-羟基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮与二碳酸二叔丁酯和碳酸氢钠按摩尔比1∶1～1.1∶1混合，加入体积比为4∶1的四氢呋喃和水的混合溶液，室温下搅拌反应2～3小时，反应结束，将溶剂减压蒸干，加入一定量的水，用1N的盐酸调pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥过滤减压蒸干得淡黄色油状产物A；