[发明专利]一种佐匹克隆人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种佐匹克隆人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述佐匹克隆人工半抗原的分子结构式如(Ⅰ)所示：

所述制备方法包括以下步骤：

(1)将6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氢-7-羟基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮与二碳酸二叔丁酯和碳酸氢钠按摩尔比1∶1～1.1∶1混合，加入体积比为4∶1的四氢呋喃和水的混合溶液，室温下搅拌反应2～3小时，反应结束，将溶剂减压蒸干，加入一定量的水，用1N的盐酸调pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥过滤减压蒸干得淡黄色油状产物A；

(2)将淡黄色油状产物A、4-甲基-1-哌嗪甲酰氯盐酸盐按摩尔比1∶1.5～2.0混合，加入吡啶溶解，在-10℃冰浴中搅拌反应3小时，然后缓慢升温至室温，减压蒸干溶剂，倒入冰水，静置析出固体，过滤，烘干得灰白色固体B；

(3)将灰白色固体B溶于体积比为1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室温下搅拌反应16小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入10％的碳酸钾溶液，用6N的盐酸调pH＝6，用二氯甲烷洗涤两次，收集水相用1N的氢氧化钠调pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干得黄色油状物C；

(4)将黄色油状物C溶于无水乙醇中，置于0℃冰水浴中，再加入乙醇钠和丙烯酸叔丁酯，室温下搅拌反应18小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再分别用纯化水和饱和的食盐水洗涤，取有机相干燥、过滤、减压蒸干得棕色油状物D；

(5)将棕色油状物D溶于体积比为1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室温下搅拌反应16小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入双蒸水，加入碳酸钠固体至没有气泡为止，用6N的盐酸调pH＝6，用二氯甲烷洗涤两次，收集水相用1N的氢氧化钠调pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干得棕色油状物Ⅰ，即佐匹克隆人工半抗原。

2.一种佐匹克隆人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：所述佐匹克隆人工抗原的分子结构式如(Ⅱ)所示：

所述制备方法包括以下步骤：

(1)将6-(5-氨基-2-吡啶基)-6，7-二氢-7-羟基-5H-吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮与二碳酸二叔丁酯和碳酸氢钠按摩尔比1∶1～1.1∶1混合，加入体积比为4∶1的四氢呋喃和水的混合溶液，室温下搅拌反应2～3小时，反应结束，将溶剂减压蒸干，加入一定量的水，用1N的盐酸调pH＝3，再用乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥过滤减压蒸干得淡黄色油状产物A；

(2)将淡黄色油状产物A、4-甲基-1-哌嗪甲酰氯盐酸盐按摩尔比1∶1.5～2.0混合，加入吡啶溶解，在-10℃冰浴中搅拌反应3小时，然后缓慢升温至室温，减压蒸干溶剂，倒入冰水，静置析出固体，过滤，烘干得灰白色固体B；

(3)将灰白色固体B溶于体积比为1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室温下搅拌反应16小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入10％的碳酸钾溶液，用6N的盐酸调pH＝6，用二氯甲烷洗涤两次，收集水相用1N的氢氧化钠调pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干得黄色油状物C；

(4)将黄色油状物C溶于无水乙醇中，置于0℃冰水浴中，再加入乙醇钠和丙烯酸叔丁酯，室温下搅拌反应18小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再分别用纯化水和饱和的食盐水洗涤，取有机相干燥、过滤、减压蒸干得棕色油状物D；

(5)将棕色油状物D溶于体积比为1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液，室温下搅拌反应16小时，结束反应，减压蒸干溶剂，加入双蒸水，加入碳酸钠固体至没有气泡为止，用6N的盐酸调pH＝6，用二氯甲烷洗涤两次，收集水相用1N的氢氧化钠调pH＝10，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，干燥、过滤、减压蒸干得棕色油状物Ⅰ，即佐匹克隆人工半抗原

(6)将步骤(5)获得的佐匹克隆人工半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺按摩尔比1∶1.35～1.5∶1.35～1.5混合于N，N-二甲基甲酰胺中，20～30℃下搅拌反应18小时，反应结束后离心取上清液；

(7)将上述上清液滴加到牛血清蛋白溶液中，混合液置于4℃下静置过夜，经透析、离心取上清，获得佐匹克隆人工抗原。

3.如权利要求2所述佐匹克隆人工抗原的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1∶5。