[发明专利]一种萝卜苗质外体抗冻蛋白的提取方法

说明书

本发明公开了一种萝卜苗中质外体抗冻蛋白的提取方法，其包括以下步骤：(1)样品的冷诱导处理；(2)提取缓冲液的制备；(3)萝卜苗的切块；(4)水洗，去除细胞内蛋白的污染；(5)真空渗透；(6)离心。通过本发明可以实现快速高效地从冷诱导的萝卜苗中提取质外体抗冻蛋白，且简单易行，适用于工业化生产，尤其能满足在食品及其相关行业中的应用。

技术领域

本发明涉及抗冻蛋白的提取方法，具体涉及一种萝卜苗质外体抗冻蛋白的提取方法。

背景技术

1964年在黄粉甲幼虫中发现抗冻蛋白，随后人们已经在鱼类、昆虫、植物、微生物等多种生物中发现存在抗冻蛋白。它是生物体受到低温胁迫时产生的并能够防止细胞受到冰冻伤害的一类蛋白质。抗冻蛋白具有热滞活性、重结晶抑制活性和冰晶形态效应，在低温下与冰晶的形成直接相关，通过降低溶液的冰点、抑制大冰晶的形成从而对组织细胞发挥保护作用。然而目前报道的动物来源的抗冻蛋白在生物体内仅微量存在，且提取效率低，因此难以实现工业化生产及其应用。

植物在受到低温胁迫时，诱导产生抗冻蛋白。人们在沙冬青、萝卜、珠芽蓼和冬小麦等多种植物中发现了抗冻蛋白。植物抗冻蛋白可存在于植物的根、茎、叶等不同组织器官中。抗冻蛋白在细胞中的定位复杂，可存在于胞间隙、细胞膜、细胞质、细胞核等多种细胞器中，目前发现植物抗冻蛋白在质外体中含量较高。

发明内容

本发明提供了一种从萝卜苗中提取质外体抗冻蛋白的方法，利用该方法可以快速、高效地从经冷诱导的萝卜苗中提取质外体抗冻蛋白，本发明提出，萝卜苗在低温胁迫时诱导产生抗冻蛋白，能够提供稳定来源且价格低廉的抗冻蛋白，具有广阔的市场应用前景，为抗冻蛋白的工业化生产及其应用提供技术支撑。

本发明提出的一种从冷诱导的萝卜苗中提取质外体抗冻蛋白的方法，将经培养的萝卜苗，在低温下进行冷诱导，然后切块，经水洗、真空渗透、离心，收集液体即为质外体抗冻蛋白。

本发明将萝卜苗进行冷诱导后，然后进行切块，切块的长度为2～5cm。本发明将萝卜苗进行切块的目的是有利于质外体蛋白的充分提取。

本发明中，对切块后的萝卜苗，进行水洗的目的是去除切块时导致的破损细胞释放细胞内蛋白，从而对即将提取的质外体蛋白造成的污染。

本发明将萝卜苗经水洗后，可以不进行擦干然后进行真空渗透离心；优选擦干后进行真空渗透离心。

其中，所述真空渗透步骤中，将所述萝卜苗与提取缓冲液放入容器中，抽真空，进行真空渗透处理。其中，在抽真空后，还包括将气压再缓慢恢复到正常大气压的步骤。优选地，将所述萝卜苗与提取缓冲液放入具塞的容器中。

其中，所述提取缓冲液包括10-50mM的抗坏血酸、10～20mM的CaCl₂，pH为3-5；优选地，为20mM的抗坏血酸、20mM的CaCl₂，pH＝3。

其中，所述萝卜苗与提取缓冲液的质量比为1：(10-30)；优选地，为1：20。

其中，所述萝卜苗包括但不限于白萝卜苗、胡萝卜苗、水萝卜苗或其他萝卜苗等之其中一种或几种；优选地，为白萝卜苗。

其中，所述经培养的萝卜苗是在适用于植物培养的自来水、蒸馏水、和/或营养液之一种或几种中培养。所述营养液包括但不限于Hoagland’s营养液、改良Hoagland’s营养液、格里克基本营养液等。优选地，所述营养液为Hoagland’s营养液。

所述改良Hoagland’s营养液配为：在Hoagland’s营养液基础上，添加136mg/L的磷酸二氢钾。

其中，所述“低温下进行冷诱导”是指萝卜苗处于1-20℃的温度下进行诱导；优选地，诱导温度为1-15℃；更优选地，为1-10℃。若不满足上述低温下进行冷诱导的条件，质外体抗冻蛋白的含量会显著降低。