[发明专利]一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用

说明书

本发明公开了一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用，所述痘苗载体质粒展示系统的表达框核心组分包括修饰的痘苗病毒H5启动子、大肠杆菌EM7启动子、串联的组氨酸标签、能结合链霉亲和素的多肽片段Nano‑tag15、红荧光蛋白mCherry、Zeocin抗性蛋白、痘苗病毒D8蛋白穿膜区。本发明基于上述质粒构建的重组痘苗病毒能够在病毒外膜表面展示Nano‑tag15，并籍此将重组病毒被链霉亲和素磁珠捕获，以及表面展示红荧光蛋白mCherry与Zeocin抗性标志物，为通过磁珠分选、荧光标记示踪和流式细胞仪分选及药物抗性等方法单独使用或联合使用而快速筛选重组痘苗病毒提供了新的有力手段。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及其应用。

背景技术

痘苗病毒(vaccinia virus)是迄今发现的最大、最复杂的病毒之一，它是预防天花的活疫苗病毒。天花在全球根除后，痘苗病毒作为基因工程表达载体得到深入研究和广泛应用。基于该病毒以下特点，使得它在肿瘤基因治疗领域得到越来越广泛的应用：①安全：痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合进宿主细胞基因组，无致癌性等安全问题；②表达效率高：痘苗病毒可培养到很高滴度(＞10⁹pfu/ml)，通常感染1-3小时，无需任何药物抗性筛选，可使90％以上的受感染细胞表达目的基因产物；③感染细胞范围广泛：可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞；④对分裂和非分裂细胞均能感染/转导；⑤基因组容量大：至少可插入25kb的外源基因而不影响其遗传稳定性；⑥对热稳定：方便现场使用和运输；⑦成本低廉；⑧表达产物近乎天然构型：它表达的产物能经历正确的糖基化，翻译后加工，接近天然构型，而这些对于疫苗载体激发免疫反应是至关重要的；⑨产生有效免疫应答：重组痘苗病毒产生活病毒自然感染过程，使所表达的外源抗原连同病毒自身蛋白一起，为宿主MHC共提呈，不但能产生体液免疫，还能激发细胞免疫，且免疫应答强效、持久，一般不需复种。更重要的是，痘苗感染能给宿主提供“危险信号”，激发机体有效产生针对载体本身及其所表达抗原的T细胞免疫反应，甚至还能激发机体对原本天然抗原性很弱的免疫原(如CEA)也产生强烈的免疫反应。

在上述和其它痘苗病毒相关研究与应用中，限速步骤是构建和筛选重组痘苗病毒。自从上世纪八十年代痘苗病毒首次用作基因工程表达载体并开展相关研究以来，构建和筛选重组痘苗病毒的主流方法一直是基于同源重组原理，即首先构建重组痘苗病毒表达载体质粒，将外源目的基因置于天然或人工合成的痘苗病毒启动子控制之下，将该表达盒插入某个痘苗病毒非必需基因(最常用的是痘苗病毒TK基因)片段中间，当该重组质粒转染已经被野型痘苗病毒感染的细胞时，通过在细胞内重组质粒中目的基因左、右旁侧非必需基因序列与野型痘苗病毒基因组内同样的非必需基因序列发生同源重组，从而将外源目的基因插入痘苗病毒相应的非必需基因中，完成重组痘苗病毒的构建。

然而，如果不加特别处理，上述同源重组产生重组痘苗病毒的几率仅有0.1％，因此，为提高重组痘苗病毒的筛选效率，都需要附加其它处理。经典的筛选重组痘苗病毒的方法如：化学试剂5-溴脱氧尿苷(5-BrdU)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，在病毒TK基因编码的胸苷激酶催化下被磷酸化而渗入子代病毒基因组DNA，导致致死性效应，故TK基因完整的野型痘苗病毒在5-BrdU存在下不能复制存活，而在重组痘苗病毒中，目的基因已经将TK基因插入失活，故不受5-BrdU的致死性效应影响而可以持续复制扩增，通过5-BrdU的选择性压力，而将具有TK阴性表型的重组痘苗病毒从占多数的具有TK阳性表型的野型痘苗病毒混合物中筛选出来。然而，该经典方法除了步骤繁多以外，需要特殊的细胞株即TK表型阴性的TK—143细胞株。此外，5-BrdU选择性压力只能够筛选出TK阴性表型的痘苗病毒，但野型痘苗病毒的TK基因具有一定频率的自发性突变，也产生TK阴性表型，而5-BrdU筛选不能区分之，故5-BrdU选择性压力只能够筛选出TK阴性表型的痘苗病毒但不一定就是重组病毒，也包括因为自发性突变而产生的非重组病毒。