[发明专利]基于细胞外衍生基质修饰的丝素蛋白多孔支架的制备方法

说明书

本发明公开了属于生物材料技术领域的一种基于细胞外衍生基质修饰的丝素蛋白多孔支架的制备方法。本发明利用心肌成纤维细胞对丝素蛋白多孔支架进行修饰，得到的支架材料表面具有细胞外基质组份，同时DNA残留低于5%，并且该支架材料具有良好的生物相容性，为工程化心肌组织的体外构建提供了良好的支架材料。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于细胞外衍生基质修饰的丝素蛋白多孔支架的制备方法。

背景技术

支架材料是种子细胞粘附和生长的基础，也是心肌组织工程基础。支架材料的特性和结构决定着工程化组织的形态与功能。与骨、软骨、皮肤等组织不同，心脏的组织结构较为复杂，其对支架材料的理化特性要求更高。近年来，基于仿心肌细胞外组份、取向结构、力学、电生理特性的支架材料构建更具仿生特性的心肌组织研究进展迅速，进一步利用天然心肌的微环境结构特点，研发基于仿心肌细胞外基质组份及微结构的支架材料构建工程化心肌组织受到广泛关注，目前有报道利用胶原、全器官脱细胞基质等天然细胞外基质组份构建工程化心肌组织备受关注。

细胞衍生细胞外基质材料作为天然生物材料的一种，是利用化学试剂、物理冻融等方法对细胞进行脱细胞基质，从而获得没有细胞核存留，但具有天然细胞外基质(ECM)特性的生物支架材料。这种细胞衍生的细胞外基质材料的优点在于，与组织来源的ECM支架相比，细胞衍生的ECM基质由于其培养及扩增时可有效排除病原体污染。其可以保持良好的天然细胞外基质成分，且这种细胞衍生的ECM基质可保留细胞原有的印迹，对再接种细胞具有一定的调控作用。同时，与组织来源的ECM支架相比，细胞衍生的细胞外ECM可塑性强，可对其他材料进行有效的修饰。但是这种细胞衍生的ECM材料也存在一定程度的缺点，如在脱细胞的过程中涉及的物理和化学方法可能使原有的细胞中因子流失，细胞衍生的基质与组织衍生的基质相比较少等。心肌成纤维细胞(CFs)约占正常心肌组织细胞总数的60％-70％，其广泛存在于心脏组织中，包绕心肌细胞。心肌成纤维细胞分泌的细胞外基质作为心脏基质的重要组成部分，其与心脏发育、结构、细胞信号系统、电机械功能等密切相关。因此，心肌成纤维细胞衍生的基质材料作为提供细胞生长的重要微环境因素受到广泛关注。已有研究报道，Gu等人通过用施旺细胞衍生的ECM与壳聚糖材料重建新型支架，用于组织工程神经修复。而目前细胞衍生细胞外基质用于心肌组织构建的研究尚未见报道。

蚕丝来源于家蚕茧，是一种被广泛使用和研究的蛋白质聚合物的生物材料。蚕丝分为丝胶蛋白和丝素蛋白，其中丝素蛋白为主要成分，约占到70-80％。丝素蛋白在形成不同材料时具有显著的机械性能，表现出较好的生物相容性，具有可控的降解速率，并且可以通过化学改性以改变表面性质或固定生长因子。目前研究可从蚕茧中提取丝素蛋白以研制水凝胶，海绵支架，纤维支架，微球和薄膜等。丝素蛋白材料可直接用作体内植入物，可作为组织工程和体外疾病研究模型中的支架，以及用于药物递送等。David L.Kaplan团队已利用丝蛋白多孔支架体外成功构建出脂肪组织、肾组织、软骨组织以及脑皮层组织。Shoei-Shen Wang等也利用丝素蛋白多孔支架携带骨髓间充质干细胞进行大鼠心梗修复研究，也取得了良好的效果，证实复合物可以有效提高移植细胞在心梗区的滞留和存活。然而，丝素蛋白支架存在材料组份单一，不具有细胞外基质组份微环境组份，仿生能力不足的问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种基于细胞外衍生基质修饰的丝素蛋白多孔支架的制备方法。

为实现上述技术目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种基于细胞外衍生基质修饰的丝素蛋白多孔支架的制备方法，将心肌成纤维细胞接种到丝素蛋白支架材料上进行培养，得到修饰后的丝素蛋白多孔支架。

上述多孔支架的制备方法，按照如下步骤进行：

S1.丝蛋白预处理，方法如下：将蚕茧剪碎并放入质量分数为17％的煮沸的碳酸钠水溶液中煮30分钟，取出冷却并挤出水分，然后用水漂洗丝蛋白20 分钟，取出后通风干燥；